依赖纳米载体的新型基因编辑技术成功治愈宫内胎鼠的β地贫症，一次注射就可以纠正~6％的突变丨医麦猛爆料
2018年7月14日/医麦客 eMedClub/--在过去十年中，用于纠正致病突变位点的特异性基因编辑已成为改善遗传疾病最有吸引力的方法，其大量努力旨在开发基于核酸酶的编辑工具，如CRISPR/Cas9。
近日，由卡内基梅隆大学和耶鲁大学的科学家开发的新一代基因编辑系统成功地治愈了活体小鼠子宫内胎儿的遗传性血液疾病。这项报道在Nature Communications上的研究，为胎儿发育过程中的发生的遗传疾病提供了一个全新的治疗思路。
该研究为胎儿发育过程中治疗遗传疾病的研究提供了新途径
研究人员采用Danith Ly课题组研发的基于肽核酸（peptide nucleic acids，PNAs）的基因编辑技术，使用FDA批准的纳米颗粒将与供体DNA配对的PNA分子递送至遗传突变位点。
这项研究中，孕鼠的幼崽携带导致β地中海贫血的β珠蛋白基因突变，治疗方法是通过类似于羊膜穿刺的技术（卵黄静脉（IV）或羊膜内（IA）注射）将PNA复合物注射到孕鼠的羊水中。
结果发现：只需在妊娠期注射一次PNA就可以纠正6％的突变，而这6％的校正足以显著改善小鼠出生后β地中海贫血疾病症状，并且足以使小鼠被视为治愈。在子宫内进行过治疗的小鼠血红蛋白水平恢复正常，并且脾肿大减少，存活率增加。
Danith Ly课题组（图片来源：chem.cmu.edu）
实现子宫内治病，
这到底是一项怎样的技术？
其实早在2016年，Danith Ly 课题组就开始使用PNA基因编辑技术，并且治愈了小鼠的β地中海贫血，而当时是通过简单的静脉治疗。
PNA基因编辑技术原理：
当PNA-DNA复合体识别出指定突变时，PNA分子与DNA结合并解开它的两条链，让供体DNA与有缺陷的DNA结合，促使细胞DNA修复途径发挥作用，从而纠正错误。
所述的PNA由尾钳PNA（tcPNA）设计而成，γ-骨架位置被微型聚乙二醇（mini-PEG）侧链取代，增加了的溶解度与生物相容性；此外，聚乙二醇基团的特殊立体化学提前将PNA分子变为右手螺旋结构，进一步增强PNA分子对DNA靶标的结合亲和力。
PNA不容易穿过细胞膜并且在静脉内或腹膜内施用后10-30分钟内会被快速清除，因此研究人员应用已被FDA批准用于多种药物的递送载体，即聚（乳酸-共-乙醇酸）（PLGA）制成的纳米颗粒（NPs）。γtcPNA以及用于校正β-珠蛋白基因中引起β-地中海贫血的IVS2-654突变的供体DNA可以有效地包裹在纳米系统中，成为新一代PNA/DNA NPs制剂。与裸寡核苷酸处理相比，PNA/DNA NPs制剂在体外和体内均可导致数千倍的基因编辑。
子宫内治病听上去有点不靠谱，
安全性有保障吗？
因为这项工作代表了在子宫内进行NP介导的基因编辑的第一次尝试，研究人员也不敢掉以轻心。在胚胎发育15.5天（E15.5）后，他们向孕鼠的卵黄静脉（IV）或羊膜内（IA）注射了荧光PLGA NPs颗粒，以观察这些纳米颗粒在孕鼠及其幼崽的体内分布。
向卵黄静脉（IV）注射NPs递送后，E15.5和E16.5时观察到小鼠幼崽体内的荧光颗粒分布广泛，其中肝脏中积累最丰富，而且孕鼠的肝脏没有观察到颗粒的积累。另外，由于胚外卵黄静脉随着胎儿发育将吻合形成门脉循环，因此预计幼崽肝脏将会有大量积累。
向羊膜内（IA）注射NPs后，NPs存在于羊水中，在E15.5时胎儿内没有检测到颗粒积聚。而在E16.5、E17.5和E18.5进行IA注射，都能观察到肺和肠中有类似的NPs积累，并且随着胚胎发育NPs的积累也增强。同IV一样，母体小鼠中没有颗粒积累。
荧光NPs在孕鼠（上）、幼崽（左下）、幼崽器官（右下）中的分布
为什么在胎儿发育16.5天，
仅比15.5天多了一天就能出现如此不一样的效果？
原来，E16.5正是胎儿发生明显呼吸和吞咽的预期时间，那就不难解释这个现象了。在哺乳动物胎儿发育期间，胎儿呼吸羊水进出发育中的肺部，为指导肺部发育和生长提供必要的力量，而发育中的胎儿也会吞咽羊水，这有助于形成胃肠道。
因此，在E16.5之后，胎儿可通过呼吸和吞咽羊水将NPs吸收至呼吸道和胃肠道，并且随着呼吸和吞咽强度增强，吸收的NPs也就越多。
经过大量研究，他们还发现与未处理小鼠（假手术）相比，野生型小鼠的幼崽接受治疗后，生存期没有显著差异，而且在幼崽出生和发育成熟后，生长模式或体重方面也没有显着差异，并且没有观察到严重的解剖学畸形，发育异常或肿瘤，还能成功怀孕。
经IV递送PNA/DNA NPs后的48小时内，幼崽的血浆细胞因子水平与对照组相比没有出现促炎细胞因子的显著增加。换句话说，这种治疗方式应用在小鼠身上可以认为是安全的。
下一步，研究人员检测了该疗法的治疗效果。
研究人员采用转基因Hbbth-4/Hbb+小鼠作为β地中海模型，并且在E15.5时经卵黄静脉递送PNA/DNA NPs。
转基因Hbbth-4/Hbb+小鼠
两个（顺式）鼠β-珠蛋白基因被单个拷贝的人β-珠蛋白基因替换，该基因在内含子2的第654位含有β-地中海贫血相关的剪接位点突变。不是纯合型的小鼠出生后存活。杂合型的小鼠产生减少量的小鼠β-珠蛋白链并且没有人β-珠蛋白，导致β-地中海贫血以小红细胞性贫血和脾肿大为特征。
在6周龄和10周龄时，检测治疗后的杂合小鼠幼崽的血液血红蛋白浓度。在两种剂量下，经子宫内给药的幼崽发育为成年小鼠后，血红蛋白水平显著高于对照组。值得注意的是，较高剂量的γPNA/DNA NPs促使血红蛋白浓度升高，在6周龄和10周龄时产生野生型范围值。出生后，血红蛋白浓度持续升高，并且伴随着外周血涂片上红细胞（RBC）形态的明显改善。
相比之下，未经治疗的小鼠外周涂片继续显示异细胞增多症，小细胞增多症和大量靶细胞等β-地中海贫血的标志。
治疗后血红蛋白浓度显著升高，外周血涂片上红细胞（RBC）形态明显改善
杂合小鼠的脾脏显著增大，这与地中海贫血患者中出现的由于髓外造血症引起的脾肿大相一致。给药后15周，成年小鼠与对照组相比脾脏重量减少73％。观察到的脾肿大的减少与小鼠的脾结构改善相关，治疗后的小鼠具有白髓和周围红髓之间的正常分界，类似于野生型小鼠。同样地，根据免疫染色结果，CD44、CD71、E-钙粘蛋白和CD61减少，表明髓外造血的减少。
总之，治疗小鼠中脾肿大的减少和脾组织学结构的改善表明治疗减轻了贫血症状。
脾肿大状况得到显著改善
除了血红蛋白水平升高，红细胞形态改善和脾肿大减少外，研究还发现治疗后的小鼠外周血中网织红细胞计数显著降低，再次表明贫血的实质性纠正。
外周血中网织红细胞计数显著降低
重要的是，与对照组相比，子宫内用NPs处理后的幼崽显示出显著的出生后存活优势。在出生后500天，经治疗的小鼠具有100％的存活率，而未处理组的存活率仅69％。
出生后500天内，经子宫内治疗的小鼠存活率为100%
为了量化在促使贫血症状改善的小鼠中实现基因编辑的程度，研究者对从出生后小鼠的总骨髓中提取的基因组DNA进行了为时15周的深度测序分析。治疗后，检测在总骨髓中靶向突变得到~6％的频率的校正。深度测序还用于通过评估与γPNA的结合位点部分同源的七个其他基因组位点，以评估骨髓中的脱靶效应。
结果显示在治疗小鼠的骨髓中，这些脱靶位点处存在不可检测的突变频率。总结起来所有位点的测量到的脱靶频率<0.000002％。
PNA基因编辑纠正靶向基因β珠蛋白6.2%的突变，脱靶频率<0.000002％
优于CRISPR治疗遗传性疾病
不像依赖于外源递送的核酸酶的基因编辑技术，如锌指核酸酶、TAL效应核酸酶和CRISPR/Cas9，PNA/DNA NP制剂易于在体内施用，并已被证明具有非常低的脱靶效应，因为PNA编辑分子缺乏固有的核酸酶活性。在胎儿发育期间，避免脱靶突变具有特别重要性。
“CRISPR虽然更容易操作，但脱靶效应使它对临床治疗不一定有用，”Ly说。“在治疗疾病方面，PNA技术更为理想。它不切断DNA，它只与DNA结合，修复不正常的东西。当我们使用PNA基因编辑技术时，我们检查了5000万个样本，没有发现一个异常修改错误。”
展望
据估计，每年约有800万儿童出生时就伴随着严重的遗传疾病或先天性缺陷。通常，妊娠期间可以通过羊膜穿刺术检测胎儿是否患有遗传疾病，但在出生前没有医疗选择可以纠正这些遗传错误。
在胚胎发育早期，有很多干细胞在快速分裂。如果我们能够及早的进行干预，从而纠正基因突变，就能显著减少突变对胎儿发育的影响，甚至可以治愈这种疾病。如果婴儿出生时疾病负担较轻或者没有任何疾病，这将对孩子的生活和家庭产生深远的影响。
新一代子宫基因编辑技术有望带来突破。研究人员认为，如果在妊娠期间多次给药，这种技术可能会取得更高的成功率。他们还希望将该技术应用于其他疾病。
来源：
https://www.nature.com/articles/s41467-018-04894-2
https://www.sciencedaily.com/releases/2018/07/180709120133.htm
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