Science：Exonics公司开创性CRISPR研究令人振奋，有望突破当前杜氏肌营养不良R＆D困境丨医麦猛爆料
今天是2018年9月2日
农历七月二十三
医麦客：CRISPR的突破性研究
2018年9月2日/医麦客 eMedClub/--杜氏肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy, DMD）是一种毁灭性的肌肉疾病，平均每5000名男婴就有1人受到影响。据估计，美国约有1.5万名男孩患有DMD，全世界估计有30万名患者。
DMD是X染色体上dystrophin基因突变引起的最常见和最严重的肌营养不良症，这种突变导致患者肌肉中缺少抗肌营养不良蛋白（dystrophin），特征是进行性肌肉退化和萎缩，导致心肌病和呼吸衰竭而过早死亡。
随着疾病的进行，DMD患者常常在十几岁时就需要使用轮椅（图片来源：STAT）
dystrophin是X染色体编码的最大基因，包含约260万个碱基和多达79个外显子，在人类已经发现了超过3000种不同的突变。
8月30日，德克萨斯大学西南医学中心分子生物学教授兼主席Eric Olson博士领导的研究小组发表一项在DMD犬模型中的早期研究结果，他们使用SingleCut CRISPR基因编辑技术使犬模型心肌中的dystrophin蛋白恢复至正常表达的92％！
这项重磅研究刊登在国际顶级期刊Science上，并且获得了同期的专题报道。尽管在人类试验开始之前，必须进行更多的动物实验以显示安全性和有效性，但CRISPR先驱Jennifer Doudna在一项会议上听到相关结果时仍表示：“我也忍不住感到非常兴奋”。
Eric Olson博士（图片来源：endpts）
值得注意的是，领导研究的Eric Olson博士同时也是Exonics Therapeutics公司的创始人兼首席科学顾问，此前他也在细胞和小鼠模型中使用该基因疗法，并且已经证明单次全身施用SingleCut CRISPR基因编辑组分足以有效地恢复具有人源化突变的小鼠中所有骨骼肌和心肌中的dystrophin蛋白表达。
在展示本次的重磅研究结果之前，不妨先来说一下ExonicsTherapeutics公司的SingleCut CRISPR基因编辑技术到底是个啥玩意？
首先，要理解的是，mRNA在成熟时需要把内含子剪掉，把剩下的外显子给拼接起来，然后翻译成正常的蛋白质。而DMD患者由于dystrophin基因突变会导致外显子的缺失，由此产生的后果是，缺失外显子的旁边2个外显子得强行拼接起来，这时会导致外显子往往会脱离编码框架，阻碍dystrophin蛋白的产生。
Exonics的开发策略（图片来源：Exonics）
注：DMD中的突变删除了绿色的外显子
正如Exonics公司的开发策略（上图），研究人员的意思是，还不如直接跳过不能很好拼接的外显子，虽然这样产生的dystrophin蛋白会缺少几个氨基酸，但仍然具有功能。况且先前的研究表明，将dystrophin蛋白表达增加至正常水平的15％即可为DMD患者提供显著的治疗益处。
其实关于外显子跳跃，并非没有先例，FDA曾在2016年加速批准了Sarepta公司的Exondys 51 (eteplirsen) 注射液，这也是首款DMD药物。eteplirsen能结合未成熟mRNA并且掩盖住51号外显子，从而在翻译成蛋白质时跳过51号外显子，临床结果显示肌营养不良蛋白的产生增加，但其疗效一直备受争议。
eteplirsen机制（图片来源：info-farmacia）
Exonics最初研发策略是针对DMD疾病中最大比例（13%）的外显子突变，即50号外显子被删除。他们通过AAV9载体递送CRISPR/Cas9相关组分，在51号外显子前剪出个小口子，随后有可能产生2种结果，“Skipping”或“Reframing”，即编码dystrophin蛋白时跳过51号外显子或者51号外显子经重构能与49号外显子很好的拼接。但不管怎样，都能重建mRNA阅读框架以恢复dystrophin蛋白的产生。
SingleCut CRISPR机制（图片来源：Science）
Science：令人振奋的研究结果
该项研究项目中患有DMD的比格犬在草地玩耍（图片来源：RoyalVeterinary College）
首先，研究人员对2只1月龄犬的颅侧胫骨肌（IM）进行注射，剂量为1.2x10^13vg/kg。
6周后，他们对2只比格犬进行了安乐死和组织学分析。蛋白质印迹分析证实了骨骼肌中dystrophin蛋白的表达恢复了约60％的野生型水平，而在未注射的对侧肌肉中仅检测到2％的野生型水平。此外，H＆E（苏木精-伊红）染色结果表明，注射的肌肉似乎更趋于正常化，具有较少的超收缩或坏死纤维，水肿和纤维化减少以及炎性细胞浸润较少的区域。
肌内注射静脉内注射：蛋白质印迹和H＆E染色结果
基于IM注射的高校正效率，研究人员随后对2只1个月龄犬进行静脉内（IV）注射，采用了2种剂量，分别是2x10^13vg/kg（1A）和1x10^14vg/kg（1B），并在8周后进行分析。免疫染色结果显示，相对于低剂量组，高剂量组在全身多处肌肉中显示更趋于正常的dystrophin蛋白表达水平，尤其是心肌。
静脉内注射：免疫染色结果
dystrophin蛋白（绿色）在正常肌肉细胞中很丰富，几乎不存在于DMD细胞中。
此外，蛋白质印迹分析证实，对于低剂量组（1A），dystrophin蛋白表达恢复至颅侧胫骨肌、肱三头肌和肱二头肌的野生型水平的~50％、20％和3％；对于高剂量组（2B），恢复至~70％、25％和64％，而膈肌、心肌和舌肌恢复至野生型水平的~58％、92％和5％。H＆E染色结果与IM注射后相似。
静脉内注射：蛋白质印迹和H&E染色结果
结果表明，肌肉中的dystrophin蛋白经SingleCut CRISPR治疗后可恢复到较高水平。
Olson博士说：“整个基因校正和恢复dystrophin蛋白表达的效率令人惊讶，并且仅用了8周。这些发现超出了我最乐观的预期。”
牛津大学MRC功能基因组学部解剖学教授、DMD研究领域的先驱Dame Kay E. Davies博士表示：“这是一个非常非常令人兴奋的论文，因为它表明基因编辑在DMD的大型动物模型中可以合理有效地应用。“
然而，这项研究虽然令人鼓舞，但却是初步的，并且有一些局限性，包括分析的动物数量相对较少（4只）以及分析持续时间短（6-8周）。
另外，虽然研究人员对预测的脱靶位点的初步深度测序分析显示，在处理过的动物中没有特定的脱靶基因编辑高于背景水平，但在更长时间的研究中，进一步评估可能的脱靶诱变是非常重要的。
而在人体中测试这种技术还为时过早，Exonics的首席执行官John Ripple说：“我们的下一步是继续临床前工作，在临床试验之前我们需要做更长时间的动物研究，确保能维持长期的疗效。”
John Ripple（图片来源：endpts）
DMD存在极大未满足的医疗需求
针对DMD药物的临床开发屡屡受挫，正如近日辉瑞宣布终止domagrozumab单抗的两项2期临床研究，还有包括诺华、安进和Shire在内的制药巨头都曾遭受过DMD临床试验的挫败。
事实证明，在解决这类严重肌肉疾病方面存在很大问题。目前，在美国只有一种获批的DMD治疗方法，即上述Sarepta公司开发的eteplirsen，并且是在没有显著疗效数据的情况下被FDA批准，也反应出对新药的强烈需求。
显然，DMD是一块难啃的大骨头，患者仍然迫切需要治疗，而越来越多的生物技术公司也正在转向基因疗法以求突破。Exonics是希望开辟这种治疗新路径的几家制药公司之一，辉瑞在受挫后也将全力推进PF-06939926的基因治疗计划。其它公司还包括Sarepta、Solid Bio等，它们也公布了部分令人印象深刻的早期结果。
针对极大未满足的医疗需求，我们也期待CRISPR能最大化其基因剪刀的优势，帮助更多的患者。
参考出处：
https://doi.org/10.1126/science.aau1549
http://exonicstx.com/in-the-news/exonics-announces-publication-research-demonstrating-gene-repair-technology-restored-dystrophin-expression-canine-model-duchenne-muscular-dystrophy/
https://www.genengnews.com/gen-exclusives/duchenne-muscular-dystrophy-mutation-in-dogs-reversed-by-crispr-cas9/77901142
https://www.biospace.com/article/-cp8r-pfizer-terminates-two-dmd-studies-following-data-review/
https://endpts.com/as-rd-setbacks-multiply-a-pioneering-crispr-cas9-program-for-duchenne-md-continues-to-impress-in-new-dog-study/
https://endpts.com/pfizer-axes-a-key-duchenne-md-program-after-phii-flop-raising-doubts-for-a-drug-category-that-attracted-roche-and-biogen/
https://endpts.com/a-crisprcas9-startup-launches-on-the-rd-frontier-working-on-a-one-time-fix-for-duchenne-md/
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