原创丨Editas发布全球首个CRISPR在体编辑药物的全面临床前数据，用于尚无治疗选择的LCA10能否创造奇迹丨医麦猛爆料
2019年1月22日/医麦客 eMedClub/--2018年11月30日，著名华人学者张锋创立的Editas Medicine宣布美国FDA已接受公司关于EDIT-101药物的IND申请。这项临床试验是该公司创建以来启动的第一项人类临床试验，也是全球第一个在体CRISPR基因组编辑药物用于治疗Leber先天性黑朦10型（LCA10）患者。根据该公司的新闻稿，“EDIT-101有望成为世界上第一款在人体内使用的CRISPR疗法。”
LCA是由至少18种不同基因突变引起的一组遗传性视网膜退行性疾病。它是导致遗传性儿童失明的最常见原因，全世界每10万活产婴儿的发病率为2至3。LCA的症状出现在出生后的最初几年内，导致严重的视力丧失和潜在的失明。最常见的疾病形式LCA10是由CEP290基因突变引起的单基因疾病，大约占所有LCA患者的约20-30％。
EDIT-101是Editas和Allergan合作开发的基于CRISPR基因编辑技术的在研疗法，旨在去除LCA10患者中发现的CEP290基因IVS26突变所产生的异常剪接供体，并恢复正常的CEP290表达。在1/2期临床试验中，预计在年中开始患者筛查，并在2019年下半年开始给药，在美国和欧洲招募10-20名患者。
2019年1月21日，权威期刊Nature Medicine发表了EDIT-101用于治疗LCA10的全面临床前数据和创建基于CRISPR的基因组编辑药物的方法。Editas Medicine首席科学官Charles Albright博士说：“这份重要手稿中的研究为我们最近接受的EDIT-101治疗LCA10的研究性新药（IND）申请奠定了基础，使我们更接近临床和实现基因组编辑的全部潜力的目标。我们期待开始进行1/2期研究，以进一步评估EDIT-101对LCA10患者的安全性、耐受性和疗效。”
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目前，没有批准的LCA10治疗方法。尽管基因治疗具有潜在的治愈作用，但大尺寸的CEP290编码序列（~7.5千碱基）超过了AAV（腺相关病毒）的包装能力。为克服这一局限，Editas开发了一种特异于CEP290 IVS26突变的基因编辑策略。
EDIT-101使用AAV5载体通过视网膜下注射将金黄色葡萄球菌Cas9（SaCas9）和CEP290特异性指导RNA（gRNA）递送至患者感光细胞。这两种gRNA对CEP290基因座具有高度特异性，没有验证的脱靶位点。当感光细胞表达基因编辑系统时，gRNA指导的基因编辑可以消除或逆转CEP290基因上致病的IVS26突变。
资料显示，大约10％的功能性中央凹视锥光感受器足以接近正常视力，研究人员假设在至少10％的中心凹视锥细胞中修正CEP290 IVS26突变将能为患者带来临床益处。
EDIT-101原理图（图片来源：Nature Medicine）
[a] EDIT-101的示意图，一种携带指定组分的AAV5载体。 U6: 人U6聚合酶III启动子; 323: gRNA CEP290-323; 64: gRNA CEP290-64; hGRK1: 人G蛋白偶联受体激酶1启动子; Kozak-ATG: 共识kozak序列和ATG起始密码子; SV40 SD/SA: 含有内含子序列的猿猴病毒40-剪接供体和剪接受体; NLS: 核定位信号; SaCas9: 金黄色葡萄球菌Cas9; pA: 多聚腺苷化信号。
[b] 编辑策略示意图。 CEP290 gRNA 323和64位于IVS26突变的侧翼，而产生的编辑包括间插序列的缺失或倒位。
■ 为了证明在成熟的人光感受器中的功效，Editas开发了视网膜外植体培养系统。用AAV5-GRK1-GFP转导视网膜外植体显示仅在含有光感受器的外核层中观察到绿色荧光，证实了GRK1启动子的光感受器特异性活性。用EDIT-101转导的视网膜外植体揭示了编辑事件的预期谱，包括插入位点的AAV载体序列的插入缺失、缺失、倒位和插入。在来自单个供体的25个EDIT-101处理的视网膜外植体中，平均编辑总率为41.7±15.9％，并且平均生产性编辑率（倒位+缺失）为16.6±6.5％。数据证明了EDIT-101在完全成熟的人类光感受器中的功能。
■ 为了全面地表征gRNA 323和64的特异性，研究人员使用了由发现阶段和验证阶段组成的逐步方法：（1）在发现阶段，候选脱靶位点识别和选择使用三个正交的方法：计算机预测参考人类基因组中紧密匹配的位点、GUIDE-SEQ和Digenome-SEQ；（2）在验证阶段，通过在U2OS和ARPE-19细胞系以及来自两个供体的人视网膜外植体组织中的靶向下一代测序来测定来自发现阶段的候选脱靶位点的合并列表。
结果表明，在两种细胞系和外植体中，没有成功测序的候选位点被证实为脱靶位点，并且大部分位点（84-88％）低于检测的下限0.1％。总之，gRNA 323和64是高度特异性的，并且在多个人细胞系或人视网膜组织中没有验证的脱靶位点。
CEP290 gRNA 323和64的特异性分析（图片来源：Nature Medicine）
■ 下一步，研究人员使用人CEP290 IVS26敲入小鼠模型来评估EDIT-101的视网膜下递送后体内靶向基因编辑效率的动力学和剂量响应。
为了确定CRISPR/Cas9表达和体内靶标编辑的动力学，研究人员使用1 μL浓度为1 × 10^12 vg/mL或1×10^13 vg/mL的EDIT-101处理HuCEP290敲入小鼠，分析时间从3天到9个月不等。
在1×10^13 vg/mL剂量下，SaCas9 mRNA在注射后第3天容易检测到，并且Cas9 mRNA和gRNA的表达在第2周显著增加并且此后稳定；在1×10^12 vg/mL剂量下，SaCas9和gRNA表达在第6周达到峰值。两个剂量组的CEP290基因编辑率在第2周的早期时间点有显著差异（双尾t检验，P<0.01）。到第6周时，1 × 10^12 vg/mL剂量组的编辑率达到21.4±4.9％的稳定水平，与1×10^13 vg/mL剂量组在第二周达到的21.2±9.6％相当。重要的是，两组的编辑峰值水平分别在研究的6个月和9个月持续时间内保持。此外，总CEP290基因编辑率与SaCas9 mRNA和gRNA的水平相关。
在HuCEP290 IVS26敲入小鼠中的体内编辑（图片来源：Nature Medicine）
根据已经公开的临床研究，Editas的研究人员推测的中心凹锥体的10％功能恢复有益于实现临床益处。他们评估了EDIT-101的剂量反应，范围从1×10^11到1×10^13 vg/mL，为达到10％或更高的生产性编辑，其中包括CEP290 IVS26靶序列的缺失和倒位，归一化为小鼠视网膜的30％转导效率。
最小治疗目标仅在少数（14％或3/21）用1×10^11 vg/mL EDIT-101 治疗眼中实现，而在3×10^11和6×10^11 vg/mL剂量下，62％的治疗眼（分别为16/26和8/15）达到10％以上的生产性编辑；在1×10^12至1×10^13 vg/mL的剂量下，94％及以上（48/51、20/20和72/75）的治疗眼达到治疗目标编辑水平。与1×10^12及3×10^12 vg/mL剂量组相比，1×10^13 vg/mL的最高剂量导致生产编辑率显著降低，目前尚不清楚原因。
这些结果预测，EDIT-101可以以3×10^11 vg/mL的剂量实现潜在的治疗效果，并且随着剂量增加至3×10^12 vg/mL而得到改善。
■ 小鼠缺乏黄斑，并且>90％的感光细胞是杆状，而LCA10的预期治疗靶点是中央凹视网膜。因此，研究人员在解剖学上与人类相似的非人灵长类动物（NHP）中评估了生产性编辑水平。
由于人类和NHP之间的序列差异，研究人员首先开发了一对替代的gRNA（cynoCEP290 gRNAs 21/51）。 AAV5 NHP载体（VIR026和VIR067）含有与EDIT-101相同的载体基因组，除了NHP CEP290 gRNA 21/51代替HuCEP290 gRNA，以及在VIR026中Cas9的C末端添加FLAG标签以外。当在人源化小鼠模型中测试时，这些载体具有与EDIT-101类似的体内活性。
在两项研究中，NHP在食蟹猴的视网膜下和在周围区域内给药，其中1×10^11或1×10^12 vg/mL的VIR026（n=3）或7×10^11 vg/mL的VIR067（n=3），每只眼睛注射体积为100μL。在接受7×10^11 和1×10^12 vg/mL处理的动物视网膜中可检测到Cas9蛋白，特别是在感光细胞中。仅在光感受器内这种限制性表达的SaCas9与先前发表的报道一致，该报告显示在NHP中视网膜下注射AAV5-GRK1-GFP仅限于光感受器中的GFP表达。
SaCas9表达仅限于经处理的NHP中的光感受器（图片来源：Nature Medicine）
ONL, 外核层; INL, 内核层; RGC, 视网膜神经节细胞; RPE, 视网膜色素上皮; IHC, 免疫组化; ISH, 原位杂交
NHP的编辑率显示剂量反应，1×10^11、7×10^11和1×10^12 vg /mL剂量的生产性编辑率分别为3.5±5.5％、16.1±2.8％和27.9±20.7％（平均值±标准差）。与HuCEP290 IVS26小鼠的发现一致，NHP在7×10^11和1×10^12 vg /mL的平均生产性编辑率将超过预期的临床有效的目标最低阈值10％。
在不同剂量的EDIT-101和替代载体下编辑小鼠和NHP的比率（图片来源：Nature Medicine）
用于基因编辑的药物开发的复杂性之一是，它本身就是人类基因组特异性的。令人鼓舞的是，实现高于预测治疗阈值编辑率的载体剂量在小鼠和NHP之间一致，从而为首次进入人体试验的剂量外推提供了基础。
来自两个物种的数据表明，在10％以上的光感受器中产生高效的编辑率，剂量范围为3×10^11至3×10^12 vg/mL，这非常符合5×10^11 vg/mL剂量的voretigene neparvovec-rzyl（Luxturna，Spark Therapeutics）。
研究结果支持EDIT-101的进一步开发，用于治疗CEP290相关的视网膜疾病患者，以及应用基因编辑方法治疗多种遗传性视网膜疾病。
基因组编辑技术正处于从多功能研究工具转向实现其在人类遗传疾病治疗方面的全部潜力的尖端。随着这些计划向患者推进，人们开创了一类新的药物，并确定了基因编辑治疗药物的临床前开发范围。
Editas作为在体基因编辑的领先公司，为EDIT-101的临床前开发提供清晰的流程，伴随着CRISPR基因编辑技术已经显现的强大魔力，相信开发新一代临床成功的基因药物指日可待。
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参考出处：
https://www.nature.com/articles/s41591-018-0327-9
https://www.nasdaq.com/press-release/editas-medicine-announces-publication-in-nature-medicine-of-data-supporting-the-development-of-20190121-00335
https://www.editasmedicine.com/
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