中国科学家开发出新型CRISPR递送系统，光控纳米粒子实现Cas9按需释放丨医麦猛爆料

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2019年4月8日/医麦客 eMedClub/--CRISPR-Cas9依赖于工程化单指导RNA(sgRNA)进行位点识别，通过非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR)来纠正基因突变，提供了一种灵活的平台以彻底改变疾病的治疗方式。

然而，由于需要同时递送两种大分子：Cas9(约160kDa)和sgRNA(超过100个碱基对)，CRISPR-Cas9系统面临着递送障碍。

虽然病毒已成功用作递送CRISPR-Cas9系统的载体，包括腺相关病毒、慢病毒和腺病毒，但研究发现病毒载体可能导致致癌作用、插入突变和免疫原性。

为了解决这个问题，越来越多研究正在探索非病毒载体。迄今为止，各种载体，包括金纳米颗粒、黑磷、金属有机骨架、氧化石墨烯、聚合物纳米颗粒和其他纳米材料，已经有效地实现了在体外或体内递送CRISPR-Cas9。

尽管如此，为了实现基因组编辑的精确远程时间和空间控制，CRISPR-Cas9的按需释放仍然是一个难以捉摸的目标。

日前，来自南京大学、厦门大学和南京工业大学的科研人员在最新一期Science Advances上发表论文，他们设计了一种基于上转换纳米粒子(UCNP)的CRISPR-Cas9递送系统，通过制备靶向癌症治疗基因polo样激酶1(PLK-1)的sgRNA，近红外光可控释放实验性地实现了体外和体内(小鼠模型)肿瘤进展的抑制。

几十年来，基于刺激响应纳米材料设计的按需基因/蛋白质/药物递送已在纳米医学中得到广泛应用。在各种各样的控制策略中，光照调节已被证明是一种理想的非侵入性选择，可以在不引入化学污染物的情况下以高时空精度、容易地监测生物活性分子的释放。

作为新兴的纳米传感器，镧系元素掺杂的上转换纳米粒子(UCNPs)已经被开发用于将低能量近红外(NIR)辐射(800或980nm)转换为高能紫外(UV)或可见光，前者可以深入穿透身体且组织吸收最少，后者可以容易地进行光异构化或酯键断裂。这为远程操控生物分子和控制生物过程提供了一个很有吸引力的途径。

上转换纳米粒子将近红外光转换成紫外光，诱导光电接头的裂解并触发Cas9的随需释放，随后进行基因编辑（图片来源：南京大学宋玉君）

本研究中，用于近红外光控基因编辑的新型CRISPR-Cas9递送系统的设计如下图：

（图片来源：Science Advances）

A：UCNPs-Cas9@PEI的制备。CRISPR-Cas9通过光可裂解的4-(羟甲基)-3-硝基苯甲酸(ONA)分子共价锚定在UCNP(表示为UCNPs-Cas9)上，然后用聚乙烯亚胺(PEI)包被以帮助内体逃逸(表示为UCNPs-Cas9@PEI)

B：NIR触发Cas9-sgRNA向细胞核的递送用于基因编辑。(I)附着于细胞膜; (II)内吞作用; (III)内体逃逸; (IV)从颗粒释放并进入核; (V)搜索目标DNA基因座并启动DNA双链断裂进行基因组编辑。

简言之，这些被“锁”在“基因剪刀”CRISPR-Cas9体系上的纳米粒子(UCNPs-Cas9@PEI)可以通过胞吞作用途径被细胞有效内化，然后细胞质中负载的UCNPs-Cas9内体逃逸和细胞溶质释放。当暴露于无创的近红外光时，纳米粒子可发射出局部紫外光，打开纳米粒子和Cas9蛋白之间的“锁”(触发光电接头的裂解)。

接着，Cas9可以从UCNP的表面释放，进入细胞核实现可控的基因编辑。

总体而言，通过UCNP上的光依赖性小分子锚定Cas9蛋白赋予其靶向编辑功能，这将强烈增强CRISPR-Cas9技术的吸引力并促进纳米医学中开发的智能递送。

通讯作者之一宋玉君说，红外光具有强大的组织穿透性，这为在人体深层组织中安全、精准地应用基因编辑技术提供了可能。

然而，由于缺乏靶向肿瘤的特性，通过静脉内给药在肿瘤组织中观察到相对少量的纳米载体；因此，在肿瘤中积累的Cas9不足以通过NIR触发基因编辑。

因此，概念证明UCNPS-cas9@PEI允许进行基因编辑，但仅在局部施用于可接近的肿瘤之后，手术可能是优选的。作者认为，需要进一步研究以开发类似的UCNP，以实现在全身给药后靶向肿瘤或转移性结节。

参考出处：

http://advances.sciencemag.org/content/5/4/eaav7199

https://phys.org/news/2019-04-light-based-carrier-crispr-cas9-gene.html

http://www.xinhuanet.com/science/2019-04/08/c_137958632.htm

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