Cell重磅：外泌体PD-L1的抑制可诱导机体的抗肿瘤免疫和记忆功能

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2019年4月11日/医麦客 eMedClub/--免疫疗法彻底改变了癌症的治疗[1] 。免疫检查点蛋白抑制剂，如PD-L1和PD-1抗体，对大部分癌症都比较有效，包括黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾癌。但是在这些癌症当中，只有10%-30%的病人对抗PD-L1/PD-1治疗有反应。其他癌症，如前列腺癌，基本对这个无反应。患者和癌症之间治疗成功差异的基础在很大程度上仍然未知[2] 。

肿瘤细胞表面的PD-L1能结合到效应T细胞上的受体PD-1，因此抑制了T细胞的活性。PD-L1的抗体阻断能激活抗肿瘤免疫反应，从而部分癌症患者的病情得到持续缓解。2019年4月4日，《Cell》杂志刊登了加利福利亚大学Robert Blelloch等研究人员的工作成果，阐释了PD-L1活性的另一种机制，包括它在肿瘤外泌体中的分泌。文中指出去除外泌体中PD-L1可以抑制肿瘤生长，即使在抗PD-L1抗体的模型中也是如此。肿瘤来源的外泌体PD-L1可以抑制引流淋巴结T细胞的活化。系统性引入外泌体PD-L1可以挽救自身无法分泌的肿瘤生长。暴露于外泌体PD-L1缺失的肿瘤细胞，可同时或数月后抑制远处注射的野生型肿瘤细胞的生长。抗PD-L1抗体与外泌体PD-L1阻断物能共同作用，抑制肿瘤生长[3] 。 

图1 文章发表及路线概括

结果

癌细胞间PD-L1分泌的差异

作者首先比较了不同前列腺癌细胞株（PC3、DU145、LNCaP）与黑色素瘤细胞（SK-MEL-28）之间分泌PD-L1在mRNA和蛋白水平的差异。PC3和DU145中PD-L1的mRNA水平比SK-MEL-28高出15倍，LNCaP在转录水平几乎没有。但是PC3和DU145中PD-L1的蛋白质水平和SK-MEL-28基本一致，LNCaP检测不到。对于这种在mRNA水平有差异而蛋白水平无差异的情况，翻译速度也不能解释这一不一致现象。

接下来作者考虑是否是不同程度的蛋白质降解引起的，于是从蛋白质降解的两个主要通路着手，即溶酶体和蛋白酶体。通过小分子（BafA1和MG132）分别抑制溶酶体活性和蛋白酶体活性，结果表明蛋白质稳定性的差异并不能解释mRNA和蛋白质水平的不一致[4] 。

然后作者推测PD-L1可能以膜泡的形式从细胞中不同程度地分泌。经过离心和WB实验发现，虽然PC3和SK-MEL-28细胞中的PD-L1蛋白水平相似，但PC3细胞将更多的PD-L1包裹到胞外囊泡中，这可能解释了为什么PD-L1在mRNA水平和蛋白水平不一致的情况。

在体内，肿瘤细胞通过分泌更多的PD-L1以抵抗T淋巴细胞释放的干扰素（IFNγ）作用[5] ，因此，作者猜想IFNγ除了能增加细胞的PD-L1，是否也可以增加分泌到胞外的PD-L1。通过实验发现，IFNγ能以相似比例同时增加细胞和胞外的PD-L1，不过IFNγ不能增加囊泡的分泌量。 

图2 PC3细胞与SK-MEL-28细胞分泌PD-L1的差异

外泌体能特异性分泌PD-L1

作者先通过蔗糖密度梯度离心证实了外泌体中包裹了PD-L1[6] ，再通过CRISPR/Cas9敲除对外泌体生成起关键作用的两个基因（Rab27a和nSMase2）。结果电镜发现外泌体样的颗粒在Rab27a和nSMase2敲除的样本中很少存在或大量减少，WB结果显示PD-L1在敲除的细胞中也大量降低，表明Rab27a和nSMase2在外泌体生成和PD-L1中起到重要作用。

由于PD-L1是一种跨膜蛋白，随后作者进一步考察了外泌体PD-L1来源于细胞的哪种结构。通过对PC3细胞进行流式分析和免疫荧光等实验，发现外泌体PD-L1似乎不直接来自内质网或早期高尔基体。用生物素标记PD-L1进一步得出外泌体PD-L1来源于PC3细胞的表面。

图3A-F  PD-L1以Rab27a和nSMase2依赖性的外泌体形式分泌

外泌体PD-L1体外抑制T细胞活化

随后作者研究了外泌体PD-L1对T细胞活化的抑制作用是否与细胞表面PD-L1类似。PD-L1的功能可以在体外通过Raji B细胞向Jurkat T细胞呈递抗原来测定，正常情况下，这种表现会激活T细胞，通过白细胞介素-2（IL-2）的分泌来测量。通过实验发现，引入PC3细胞的外泌体PD-L1能抑制IL-2的分泌。为了进一步确定这样的作用，用CRISPR/Cas9敲除PC3细胞的Pd-l1基因，观察到引入无PD-L1的外泌体则不会抑制IL-2的分泌。因此，外泌体PD-L1的确在体外抑制T细胞的活化。

图3G-H 外泌体PD-L1体外抑制T细胞活化

外泌体PD-L1促进肿瘤发展

为了研究外泌体PD-L1在体内是否能够促进肿瘤的进展，作者使用了前列腺癌的同源模型- TRAMP-C2模型，这种临床前模型，就像人类前列腺癌一样，对抗PD-L1阻断具有耐药性。用CRISPR/Cas9敲除Rab27a和Pd-l1，会导致胞外囊泡中PD-L1的消失。将WT、Rab27a缺失和Pd-l1缺失的TRAMP-C2分别注射入C57BL6/J同基因小鼠侧翼，观察4个多月。所有注射WT TRAMP-C2细胞的小鼠在35天左右出现明显的肿瘤，并在40天至71天之间实施安乐死。相比之下，在同一时间段内，所有注射Rab27a或Pd-l1缺失的TRAMP-C2细胞的小鼠均无肿瘤生长。

为了进一步确定Rab27a缺失通过其在外泌体生成中的作用阻碍了肿瘤的生长，作者用nSMase2缺失细胞重复了这个实验。与Rab27a缺失的TRAMP-C2细胞相似，当接受WT细胞的小鼠被安乐死时，nSMase2缺失的TRAMP-C2细胞没有可以看到的肿瘤。因此，这些数据表明阻断外泌体生成或去除PD-L1可导致非常相似的肿瘤生长抑制表型。

随后作者将WT、Rab27a缺失、nSMase2缺失和Pd-l1缺失的TRAMP-C2分别注射入免疫缺陷小鼠，观察出与PD-L1一样，RAB27A和NSMASE2通过抑制免疫系统促进肿瘤生长。 

图4 外泌体PD-L1抑制同基因前列腺癌模型的肿瘤进展

外泌体PD-L1抑制引流淋巴结的T细胞活性

接下来，我们研究外泌体和PD-L1的缺失是否对肿瘤的免疫反应有类似的影响。为了解决这个问题，我们测试了注射WT、Rab27a缺失和Pd-l1缺失的TRAMP-C2细胞后淋巴组织的反应。脾脏的免疫表型显示，在这三种基因型中，CD8、CD4和调节性T细胞的比例相同，而WT和突变型小鼠引流淋巴结的免疫表型有显著差异。与WT相比，注射两种突变肿瘤细胞系后，CD8阳性细胞在T细胞中所占比例要高得多。突变体中CD4的比例相对较低，而FoxP3+ T调控细胞在T细胞中所占比例不变。随后对CD8和CD4细胞进行分析，得出这些数据与肿瘤来源的外泌体PD-L1迁移到引流淋巴结并抑制T细胞活化相一致。

为了验证外泌体通过PD-L1起作用以抑制淋巴结中的T细胞活化，进行了一系列的动物实验，结果表明了一旦T细胞在没有外泌体PD-L1的情况下暴露于肿瘤抗原，它们就会对外泌体PD-L1的抑制作用产生抗性。

图5 引流淋巴结T细胞的免疫表型预示了免疫记忆和肿瘤抑制

外泌体PD-L1促进不同肿瘤类型的生长

为了研究外泌体PD-L1对肿瘤进展的影响是否TRAMP-C2模型所独有的，作者使用了MC38的结直肠癌模型。与TRAMP-C2模型不同，该模型对抗PD-L1和治疗有部分反应。通过CRISPR/Cas9敲除MC38的Pd-l1和Rab27a，再将敲除了Pd-l1和Rab27a的细胞注射入WT小鼠中，结果显示注射WT MC38的小鼠肿瘤生长迅速，从第9天开始必须对小鼠实施安乐死，而Rab27a或Pd-l1的缺失减缓了肿瘤的生长，延长了寿命。然而，与TRAMP-C2模型不同的是，Pd-l1损失的影响要大于Rab27a损失。因此，外泌体PD-L1在该模型中似乎起着重要但不是全部的作用。

为了验证外泌体是否通过PD-L1特异影响肿瘤生长，作者构建了Rab27a和Pd-l1双敲除的MC38 细胞。通过实验发现，外泌体的功能不全是但主要是通过PD-L1的呈递起作用的。Pd-l1与Rab27a缺失对肿瘤生长影响的差异也表明，在这个模型中存在一个独立于外泌体的Pd-l1 pool，该pool也具有抑制免疫反应的功能，可能是细胞表面的PD-L1，它是抗肿瘤免疫反应的重要抑制因子，对抗体敏感。 

图6 外泌体PD-L1抑制同基因结直肠癌模型的肿瘤进展

外泌体PD-L1缺陷的肿瘤细胞可以抑制远处部位的WT肿瘤生长

作者接着研究在不同部位同时注射WT和突变细胞是否会影响肿瘤的生长，为了解决这一问题，作者将WT TRAMP-C2细胞分别注射于每只小鼠的一侧，另外一侧同时注射Pd-l1、Rab27a或nSMase2的TRAMP-C2细胞。与单独注射WT细胞的小鼠相比，在两次注射中WT肿瘤的生长显著降低，可见Pd-l1、Rab27a或nSMase2缺失细胞对远处WT肿瘤的影响相似。实验结果表明突变体一侧引流淋巴结内激活的免疫细胞能够游走并攻击对面的WT肿瘤细胞。WT肿瘤的组织学分析显示，当与另一侧的突变细胞共注射时，浸润淋巴细胞的数量显著增加。总之，这些数据显示了肿瘤之间的通讯，突变肿瘤的影响比WT肿瘤的作用更显著。 

图7 WT与突变体TRAMP-C2细胞远距离的交互通讯

外源引入外泌体PD-L1可以补救免疫抑制和肿瘤生长

接下来，作者研究外源引入外泌体PD-L1是否会抑制抗肿瘤免疫反应和促进肿瘤生长。将Rab27a缺失的TRAMP-C2细胞移植到同基因小鼠的侧腹，然后用尾静脉注射从WT或Pd-l1缺失的细胞中分泌的外泌体。结果发现，注射入来源于WT但Pd-l1不缺失的外泌体，细胞能够诱导全身免疫抑制，这点由脾脏大小减少了近50%证实。与Pd-l1缺陷外泌体相比，WT外泌体导致CD8/CD4比值降低，而对T-reg细胞几乎没有影响。为了观察对肿瘤生长的影响，考虑到MC38增长更快的特点，我们转向了MC38模型。与TRAMP-C2模型一样，将缺失Rab27a的MC38细胞注射到同基因小鼠的侧腹，然后在同基因小鼠的尾静脉注射外泌体。实验显示，注射了来自WT MC38细胞但Pd-l1缺失的外泌体，细胞能促进肿瘤生长和降低存活率。这些结果证实了外泌体通过PD-L1抑制抗肿瘤免疫反应，促进肿瘤生长。

图8 外源引入外泌体PD-L1可以补救免疫抑制和肿瘤生长

结

论

上面数据揭示了外泌体PD-L1在肿瘤细胞逃避抗肿瘤免疫方面起到了关键作用。实际上，在外泌体PD-L1存在的情况下，肿瘤引流淋巴结中的T细胞表达了衰竭的标志物，且脾脏变得越来越小。通过基因阻断外泌体生成或敲除Pd-l1，能强烈促进T细胞激活、增殖和杀伤潜能，从而逆转细胞表型。因此，外泌体PD-L1通过抑制引流淋巴结T细胞活化，成为肿瘤发展的主要调控因子，其抑制作用可导致长期的全身抗肿瘤免疫。

参考文献：

[1] Chen,D.S.,and Mellman,I.(2017).Elements of cancer immunity and the cancer-immune set point. Nature 541,321-330.

[2] Page,D.B.,Postow,M.A.,Callahan,M.K.,Allison,J.P.,and Wolchok,J.D.(2014).Immune modulation in cancer with antibodies.Annu. Rev. Med. 65,185-202.

[3] Poggio,M.,Hu,T.Y.,Pai,C.C.,Chu.B.,Belair,C.D.,Chang,A.,  Montabana,E.,Lang,U.E., Fu,Q., Fong, L., Blelloch, R.(2019).Suppression of Exosomal PD-L1 Induces Systemic Anti-tumor Immunity and Memory.Cell 177,414-427.

[4] Mauvezin,C.,and Neufeld,T.P.(2015).Bafilomycin A1 disrupts autophagic flux by inhibiting both V-ATPase-dependent acidification and Ca-P60A/SERCA-dependent autophagosome-lysosome fusion.Autophagy 11,1437-1438.

[5] Shurtleff,M.J.,Temoche-Diaz,M.M.,Karfilis,K.V.,Ri, S.,and Schekman,R.(2016).Y-box protein 1 is required to sort microRNAs into exosomes in cells and in a cell-free reaction.eLife 5,e19276.

[6] Hui,E.,Cheung,J.,Zhu,J.,Su,X.,Taylor,M.J.,Wallweber,H.A.,  Sasmal, D.K.,Huang,J.,Kim,J.M., Mellman,I.,and Vale, R.D.(2017).  T cell costimulatory receptor CD28 is a primary target for PD-1-mediated inhibition. Science 355,1428-1433.

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