权威观点：精确改造溶瘤病毒，提高免疫治疗的安全性与有效性丨医麦新观察

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2019年5月4日/医麦客 eMedClub/--溶瘤病毒(OVs)被定义为能够选择性复制并杀死癌细胞的病毒。早在20世纪初，医生就观察到癌症患者在自然感染后，出现部分疾病缓解。因此，科学家假设癌细胞在某种程度上更容易受到病毒感染，而减毒病毒株可以用于癌症治疗。然而，许多因素，包括安全考虑、细胞毒性化疗的发展，以及缺乏控制病毒的工具，阻碍了这一领域的研究。

近年来，由于对病毒基因功能的进一步了解和分子生物学的进展，使病毒基因组的精确修饰能够最大限度地提高疗效和安全性，OV研究领域又重新活跃起来。

（图片来源：BlenderNation）

在过去的几年里出现了一个新的范式，根据这个范式，OVs也可以作为一种免疫治疗的形式发挥作用。事实上，已有研究表明，病毒提供的促炎刺激可以克服TME(肿瘤微环境)免疫抑制，从而引发全身抗肿瘤免疫反应。当OVs局部注射(瘤内注射)而不是全身注射时，也观察到这种反应。

然而，OVs仍然不够强大，特别是针对几乎没有免疫原性或免疫抑制性的实体肿瘤，不幸的是，这种肿瘤在人群中非常常见，如胰腺癌、三阴性乳腺癌、肝细胞癌。这种功效的缺乏多少有些出乎意料，因为由于炎症和病毒抗原的存在，OV应使TME明显更具免疫原性。

上述考虑使人感到OV治疗领域的重大改进即将到来。如何充分开发OVs的治疗潜力显得至关重要，以下意大利帕多瓦大学分子医学系Alberto Reale等人讨论了使用溶瘤病毒进行免疫治疗的若干观点。

作者认为，更好地了解OVs在体内的作用机制和药代动力学，以及病毒和宿主之间复杂的相互作用，是进一步阐明设计更安全、更有效的OVs的关键方面。在这方面，还有一些不同的问题有待解决:

01

减毒OV应该有多“减毒”?

这个问题听起来可能不值一提，答案是“衰减到只能在癌细胞中复制”。然而，应用这一过于简单化的原则可能会产生可怕的后果，因为它没有考虑到肿瘤的真正复杂性。

鉴于癌细胞正在活跃复制而健康细胞没有，许多OVs被设计成只能在活跃分裂的细胞中复制，例如通过删除特定基因(如HSV或VACV(牛痘病毒)胸苷激酶和核糖核苷酸还原酶)。不幸的是，肿瘤块中的许多癌细胞没有进行复制。更糟的是，TME中存在许多非肿瘤细胞(包括巨噬细胞、内皮细胞、淋巴细胞、成纤维细胞、MDSCs)，这些细胞不支持根据上述原理设计的OVs复制，因此可以保护恶性细胞免受病毒扩散。

此外，由于众所周知的癌症异质性，假设所有患者中的所有癌细胞将显示相同的特定分子特征(如某些抑癌基因内的突变和/或单一途径的过表达)，并假设OV对癌细胞的特异性仅依赖于这些特征，是危险的想法。

研究表明，癌细胞对病毒复制的易感性增加，主要是在抗病毒反应和细胞周期调节途径中的可变变化组合的结果。因此，当使用已知的人类病原体来源时，产生OVs的更明智的方法可能是减弱到它们不会引起与其相关的危险疾病。即，焦点可以从“无法在非恶性细胞中复制”转移到“无法在与人类疾病相关的特定靶细胞中复制”。

目前正在研究或临床可用的溶瘤病毒概述（图片来源：Infect Agent Cancer）

就HSV-1而言，在具有免疫能力的成年人中，几乎所有严重的发病率和死亡率都是由神经元的传播和复制引起的，从而导致脑炎。因此，尽管病毒至少部分地保留了在“健康”成纤维细胞或上皮细胞中复制的能力，但能够减弱HSV-1在神经元中的毒性的基因组修饰可能足以产生安全的OV。而这个特性甚至可能是有用的，因为它使病毒在TME中更有效。

02

如何使筛选OVs的体外模型对癌细胞的选择性与体内一致?

这个问题与应用于组织培养细胞的“非恶性”定义本身有关。即使在免疫抑制小鼠中接种后不能形成肿瘤的细胞系，也常常会永生，并具有与体内同类细胞非常不同的特征，这可能导致OVs在这些“健康”细胞中复制。此外，细胞系(包括癌细胞系)对病毒复制的易感性往往是不可预测的：即使是具有广泛细胞取向的病毒，有时也会在某些细胞系中产生非常低的滴度。

这就提出了寻找一个真正的“健康”细胞系的问题，在这个细胞系中，正在评估的OV不会复制，因为该细胞系没有恶性特征，而不是因为该细胞系的特征是对该病毒的抵抗力。原代细胞虽然在技术上要求更高，但可以部分克服其中的一些困难。另一方面，源自恶性和健康组织的类器官(organoids)正在成为一种广泛应用于多种研究的体外模型，其优点是让细胞在3D环境中生长，更接近于体内情况。因此，类器官可能是测试OV对癌细胞特异性的最佳体外模型。

03

什么是测试OVs安全性和有效性的最合适的动物模型?

到目前为止，大多数研究都依赖于免疫缺陷或裸鼠，这是一种很容易获得的模型，由于免疫抑制，小鼠或人类癌细胞株可以茁壮成长。尽管如此，这一特性(特别是缺乏有效的T细胞反应)深刻地改变了OVs的作用机制。在这些模型中，病毒的直接溶瘤实际上可能是延长动物生存的主要效应机制，而这可能不会发生在人类患者身上。

使用具有免疫功能的小鼠可以部分克服这一困难。然而，小鼠和人类免疫系统之间的差异仍然是一个障碍，特别是正在评估OV影响癌细胞免疫反应的能力时。人源化小鼠，即完全免疫缺陷的小鼠，接受人造血干细胞(HSC)移植，加上人胚胎胸腺和肝脏组织，以保证T细胞成熟，可以解决这个难题。

04

宿主免疫系统/OV相互作用在决定肿瘤病毒疗法成功方面的确切作用是什么?

一些研究人员认为，免疫系统具有有害作用，因为其可以在OV能够杀死足够数量的癌细胞之前消除它，特别是如果OV来自于广泛存在于人群中的人类病原体时。因此，人们花了很多精力来隐藏病毒，使其不被免疫系统发现，或者使用那些在普通人群中不太可能存在预先免疫的病毒。

然而，这一概念显然根植于OVs直接杀死癌细胞的旧范式，而不是最近OVs作为免疫治疗工具的想法。事实上，最近的数据强烈表明，OV复制引起的危险信号和炎症的释放，以及针对受感染细胞的免疫系统激活，是OV本身的抗肿瘤潜力的重要组成部分。

在T-VEC病例中，HSV-1血清阴性和血清阳性患者的治疗效果无差异。最近一项使用副粘病毒NDV(新城疫病毒)治疗黑色素瘤小鼠模型的研究显示，对NDV具有预先免疫的小鼠具有增强的抗肿瘤活性。

此外，在肿瘤内用T-VEC治疗后，观察到未注射的病灶(包括一些内脏转移)发生消退。在最近的一项临床试验中，活化的CD8+淋巴细胞浸润预示了消退，而检查点抑制剂则增强了消退。这种模式与病毒注射在多个可及病变中引起的免疫应答一致，但对于未检测到病毒的未注射病变也有效。

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05

OV的最佳施用方式是什么?

通常认为，一个理想的OV应该是全身注射的，有一些很好的理由：从本质上讲，感染原发肿瘤和转移的可能性，以及这种途径是相对无创的，可以经常重复注射。

尽管一些OVs被静脉注射给患者，没有严重的副作用，但最常用的途径是局部(瘤内)注射。这也是唯一批准的OV即T-VEC的给药方式。通常选择瘤内给药是出于安全考虑，或者，特别是针对HSV-1，是为了尽量减少预先存在的循环抗体在病毒到达靶标之前中和病毒的机会。尽管如此，在T-VEC病例中，未注射的病灶和内脏转移显示出消退，这可能是由于病毒引起的免疫反应。

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06

OV作为转基因传递/表达的平台

病毒有一个重要的特征，这使得它们作为癌症疗法特别有吸引力：它们不仅是癌细胞杀手或促炎刺激物，而且还可以作为转基因传递/表达的平台。这一特征允许开发“武装”有治疗基因的OVs，其中一些已经在临床试验中得到评估。一个例子是，除了病毒基因中的特异性突变外，在人巨细胞病毒直接早期启动子[57的转录控制下，还携带两个人粒细胞-单核细胞集落刺激因子编码序列的拷贝。

这一特性使OVs的发展“武装”了治疗基因，其中一些已经在临床试验中评估。例如T-VEC，除了病毒基因中的特定突变外，它还携带两个受人类CMV直接早期启动子转录控制的人类粒细胞单核细胞集落刺激因子(hGM-CSF)编码序列的副本。

然而，这些工程病毒大多只表达单一的免疫刺激细胞因子或配体。因此，这些OVs没有利用最近积累的关于癌症免疫学和TME的丰富信息，甚至可能已经过时。例如，最近的综述对hGM-CSF在癌症免疫治疗中的作用提出了质疑。

癌症免疫疗法的问题不是简单地促进“沉睡”的免疫反应，而是癌细胞积极使用免疫抑制机制并募集致耐受性细胞的事实。OV可用于局部递送高浓度和恒定浓度的单链抗体或破坏那些免疫抑制特征的其他蛋白质配体。在这方面，可以设计出许多不同的策略，包括降解某些肿瘤(促纤维化反应)中存在的丰富细胞外基质的酶的表达，或免疫抑制细胞因子(例如TGF-β)的显性失活形式。

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更具体地说，是否存在表达检查点抑制剂的工程化OVs的空间，如单链抗体、完整的抗体或具有相同功能的蛋白质?

目前已有全身递送的强效免疫检查点抑制剂(CKIs)，大多数研究人员关注的是现有检查点抑制剂与OVs之间的协同作用。然而，经OVs表达为治疗基因的CKIs在TME中可能具有较长时间的局部递送优势，这在原则上可能避免了通常与全身性CKIs相关的自身免疫性副作用。

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07

有没有可能对病毒进行更广泛的细胞特异性重编程?

理想情况下，一旦OV到达TME，它应该在不同类型的细胞中产生不同的效果。当然，它应该在癌细胞中复制并导致癌细胞死亡，同时保留周围正常组织和/或不会导致严重疾病。

然而，可能还有更多的细微差别。例如，OV可以被设计成在受感染的巨噬细胞中特异性地触发Th1表型，或者在与癌症相关的成纤维细胞或内皮细胞中复制，这些细胞可能成为更持久的治疗基因产品“工厂”。在细胞特异性启动子转录控制下的转基因可能起到这一作用。虽然“启动子重定向”已被探索以增强病毒在癌细胞中的复制，但至少据作者所知，尚未研究这种TME多样性的方法。

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创新OV的设计存在广阔的空间，以更好地实现例如TME调节。理想的候选者应该是一种大型dsDNA病毒，它可以允许在其基因组中插入多个转基因，同时又不丧失其在癌细胞中复制和杀死癌细胞的能力，而且对于这种病毒，“强大的”基因编辑技术是可用的。

OVs所面临的最大挑战是免疫“冷”肿瘤的治疗，由于缺乏淋巴细胞浸润，这些肿瘤通常对检查点抑制剂没有反应。病毒的存在(特别是复制能力强的病毒)可以通过增强免疫细胞的浸润和产生促炎信号，深刻地改变TME。这是否足以使冷肿瘤对免疫检查点抑制敏感?

必须考虑的是，这些肿瘤往往表现为免疫抑制的免疫细胞浸润或纤维化的微环境，可以保护恶性细胞免受病毒的免疫原性刺激。武装OVs可能再次成为这个问题的解决方案。

事实上，被感染细胞在原位高浓度释放的治疗基因产物，可以通过杀死免疫抑制细胞或抑制其活性，与OVs协同作用。此外，OVs可以被设计用来表达降解纤维化细胞外基质的酶，从而帮助解决非常“困难”的肿瘤微环境。

参考出处：

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6371415/

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