诺奖得主发布CRISPR技术新方法，5分钟即可检测新冠病毒丨医麦猛爆料

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2020年10月14日/医麦客新闻 eMedClub News/--2020年10月7日下午，2020年诺贝尔化学奖公布。今年的诺贝尔化学奖颁给了法国和美国科学家Emmanuelle Charpentier、Jennifer A. Doudna，以表彰她们“发现了基因编辑技术中最有力的工具之一：CRISPR/Cas9基因剪刀”。

日前，Jennifer Doudna博士领导的研究小组在预印本网站MedRxiv上发布了一项最新研究数据，利用CRISPR-Cas13a技术开发了一种新型冠状病毒检测方法。该研究方法只需5分钟就能判断5位COVID-19患者，是目前基于CRISPR最快的诊断方法。

基于CRISPR技术开发的新冠检测方法

研究人员将Cas13a酶和CRISPR RNA（crRNA）结合，构成一个复合体。当crRNA与病毒RNA上的特异性序列相结合之后，能够激活Cas13a酶。

Cas13a酶被激活后，能够对附近的单链RNA分子进行切割，研究人员同时在RNA上添加荧光分子，当RNA被切断后，会释放出荧光信号。此时，对荧光信号进行捕捉，就能检测到病毒特异性序列的存在。

以前基于这一原理的CRISPR检测为了提高检测的灵敏度，会通过PCR扩增技术扩大样本量。而这款检测技术并不需要RCR扩增的过程，就可以直接定量检测样本中的病毒RNA水平，大大缩短了检测时间。

该团队曾花了几个月的时间测试了数百种crRNA，以找到多个可协同工作以提高检测灵敏度的crRNA。研究结果表示，使用单一的crRNA，可以在每微升溶液中检测到10万个病毒。如果他们添加第二种crRNA，每微升能检测100个病毒。

与此同时，研究人员还开发出了一款基于智能手机相机的检测系统，让医务人员不需要复杂的仪器，就可以在实验室以外的环境中读出检测结果。更重要的是智能手机通常都携带GPS并且可以联网。这让将读取的结果传输到云端数据库，协助接触者追踪变得更为简便。基于智能手机的新冠病毒检测系统可能在控制目前和未来的大流行方面起到重要的作用。

加州大学圣塔芭芭拉分校分子生物学家Max Wilson表示：“这看起来是一个绝对可靠的测试。”

诺奖技术助力新冠检测

新冠病毒检测对于控制疾病传播、及早诊断治疗具有重要意义。荧光定量PCR由于高灵敏度和特异性成为了新冠病毒检测的金标准。由于设备昂贵、操作繁琐，荧光定量PCR技术很难用于现场即时检测。所以，科学家一直在研究如何将CRISPR基因编辑技术应用于新冠病毒的检测中，提高新冠病毒的检测时间。

2020年2月14日，CRISPR基因编辑大神张锋教授团队发布了使用基于CRISPR/Cas13的SHERLOCK技术检测新型冠状病毒的详细操作流程文档。

文档中的测试表明，SHERLOCK技术检测新冠病毒异常灵敏，每微升里仅10-100个病毒拷贝，都可以被检测出来。而且，该方法操作简单，仅需纯化的核酸分子样本，通过简单的三步，1个小时内即可完成检测。

2020年4月17日，Nature发表了来自美国加州大学旧金山分校的研究团队，开发出的一种低成本拭子检测方法，可在40分钟内诊断新冠病毒感染。

该研究团队称，新检测的开发是基于CRISPR-Cas12的侧向流动检测技术，不需要专门的设备，在任何实验室都可进行。这与需要专门设备进行检测的 PCR 相比，确实更加方便。

2020年9月16日，张锋团队再次发表CRISPR技术的相关研究，采用逆转录、LAMP、CRISPR技术偶联的策略，并优化了核酸提取步骤，代之以简单的磁珠富集方法，实现了一步法CRISPR核酸检测（STOPCovid.v2）。

研究者通过对COVID-19临床样本进行双盲试验，结果显示新技术灵敏度93.1%、特异性98.5%，检测效力与荧光定量PCR一致。SARS-CoV-2阳性样本在15-45min内即可检出。该方法操作简单快速，灵敏准确，便于流水线批量操作，可以直接用试纸或荧光仪观察结果，成本、设备要求低。

▲ 检测流程与效果评价（图片来源：NEJM）

2020年9月18日，来自康涅狄格大学的刘长春团队在国际知名期刊Nature Communications上，发表题为“Ultrasensitive and visual detection of SARS-CoV-2using all-in-one dual CRISPR-Cas12a assay ”。

研究者开发了多合一的AIOD-CRISPR检测平台。首先设计一对crRNA分别靶向两个靠近引物的不同位点，与cas12a形成复合物，同时在反应体系中加入DNA复制相关酶系。

当RPA反应开始时，DNA双链解开并暴露出cas复合体结合位点，CRISPR-Cas识别并切割靶序列，同时活化切割报告元件，随着RPA反应进行，靶序列数量增多，活化CRISPR-Cas也增多，释放荧光数量指数级增加。

研究者发现在LED、UV光甚至照明灯下也能明显观察到颜色差异，而且反应在37℃左右就可进行，在低温环境只需暖手宝就可启动反应。研究者分别对实验室病毒载体、临床样本进行测试，仅需20min就可肉眼分辨阳性样本，精确度与荧光定量PCR一致。

该方法方便简单，可以直接观察，与相应的仪器配合使用，可以定量测定样本中病毒含量，同时成本低廉，仅需6美元。

▲ 检测原理与效果评价（图片来源：Nature Communications）

结语

CRISPR/Cas9在2012年被发现，通常简称为CRISPR，它使科学家能够在特定的点对DNA进行精确的改变，并可能改变遗传疾病的治疗。

而将CRISPR技术与核酸检测相结合，能够实现低成本、高精度、快速的核酸检测，有望应用于COVID-19疫情的检测，更好的控制疫情传播。

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