i-GONAD技术，开启原位基因编辑胚胎的新征程丨医麦猛爆料

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2021年2月8日/医麦客新闻 eMedClub News/--实验鼠一直被认为是生物医药许多领域的首选实验动物，特别是近年来，随着基因编辑技术的飞速发展，利用基因修饰的大小鼠进行人类疾病的前沿研究也取得了许多重大的成果。利用最新的CRISPR 技术，科学家现在构建出携带单个甚至多个基因突变的小鼠，并利用这些基因修饰小鼠作为人类疾病模型，一方面推动了对人类疾病分子机制和细胞信号转导的了解；另一方面也为精确绘制个体病理基因表达谱提供了重要科研数据，这为今后的个体精准医疗奠定了重要基础。

CRISPR/Cas9系统是一种高效的基因编辑技术，能够修饰哺乳动物中的特定基因功能。

传统的CRISPR动物基因工程方法的三个关键步骤：

1.超排卵雌性交配然后分离受精卵

2.显微注射基因编辑成分到受精卵中

3.转移显微注射后的受精卵到假孕雌性的输卵管中

这些步骤不仅需要非常娴熟的专业技术，还需要昂贵的设备，如显微操作系统等。一些研究小组提出在体外直接电转受精卵（TAKE方法【Technique for Animal Knockout system by Electroporation】）替代显微注射法，并利用这种方法成功生产了基因编辑幼崽。该方法虽然跳过了显微注射的步骤，但仍需经历分离受精卵、及移植回假妊娠雌性体内这两个困难步骤。

GONAD技术介绍

最近，日本学者Dr. Masato Ohtsuka及其同事开发了一种原位电转受精卵的方法（GONAD方法【Genome editing via Oviductal Nucleic Acids Delivery】），可以绕过上述繁琐困难的步骤。第一次GONAD时，使用Cas9 mRNA和sgRNA，基因编辑效率约为25% [1]。随后，使用Cas9蛋白和crRNA/tracrRNA复合物（i-GONAD方法【improved-GONAD】），基因编辑效率约为97% [2]，达到显微注射水平。该方法可以产生包含点突变、大片段基因敲除（1000bp以上）以及敲入的小鼠模型。

i-GONAD不仅可替代受精卵显微注射实现上述操作，在基因编辑效率上也可达到显微注射水平。

以上所有数据和图片均来自i-GONAD, a robust method for in situgermline genome engineering using CRISPR nucleases

在文章中，作者及其同事首先报道了最佳的电转时间，既交配后第0.7天（相当于1细胞晚期）来实施GONAD，不仅有助于溶液导入壶腹，而且不会高频率的产生嵌合体胎儿。

其次，作者报道i-GONAD可用于创建大片段缺失、点突变和大片段敲入模型。研究数据表明：

1、以C57BL/6JJcl小鼠的Agouti基因座第一内含子中的逆转座子序列为靶点，将包含该序列的16.2kb基因组区域缺失，缺失后毛色会由黑色变为棕色。有50%（3/6）幼崽出现缺失及毛色变化，共67%（4/6）被基因编辑【large deletions and short indels】。

2、在Pitx3基因的终止密码子上游插入了一个783 bp的T2A mCitrine盒/框架，显微镜下观察胎儿荧光。15%（5/34）胎儿含有敲入盒，共62%（21/34）胎儿被基因编辑【knock-in and/or indel mutations】。

第三，作者发现i-GONAD在许多小鼠品系中起作用。

在C3H/HeSlc、C57BL/6NCrSlc、DBA/2CrSlc、B6D2F1/Slc以及B6D2F1/Slc和C57BL/6NCrSlc的杂交品系的Tyr基因【Tyrosinase酪氨酸酶，负责黑色素合成】进行indel突变；C3H/HeSlc和C57BL/6NCrSlc品系的Kit基因进行indel突变；C57BL/6NCrl品系的Cdkn1a和Cdkn2a基因和BALB/cAJcl品系的Tyr基因进行ssODNs位点突变。除C57BL/6NCrSlc小鼠的Tyr位点外，所有被测位点和小鼠品系中均有基因编辑。可能是因为C57BL/6NCrSlc品系生育能力差和/或产仔数较少。

第四，AsCpf1核酸酶也可用于i-GONAD法。40只胎儿中，有65%（26/40）的胎儿被基因编辑，其中约65%（17/26）的胎儿为嵌合体。此外，作者还使用AsCpf1校正了Tyr基因的G308C突变，19只胎儿中，有58%（11/19）眼睛有色素沉着，共74%（14/19）的胎儿被基因组编辑，其中约36%（5/14）的胎儿为嵌合体。

随后，作者及其同事将这项改进的技术扩展到大鼠身上，发现i-GONAD可以在各种品系中创建基因编辑的大鼠（rGONAD方法【Rat improved GONAD】）。品系包括Sprague-Dawley和Lewis，以及F1杂交种（Sprague-Dawley和Brown-Norway），indel突变的效率约为62%，敲入效率约为9%[3]。实验方法如下：

 利用NEPA21进行体内受精卵转染操作图示

rGONAD法步骤

01 确定电转条件

通过电穿孔效率确定了rGONAD法的最适宜条件，使用NEPA21（日本NEPA GENE 产品）进行电转，参数（见图e, f）：

WKY (WistarKyot)、DA(Dark Agoutid) 和WKY/DA F1，3个品系间无显著差异（见图i, j, k）

02 基因敲除

利用rGONAD法，通过CRISPR/Cas9技术敲除野生型Tyr基因（KO）

03 基因敲入

利用rGONAD法，对突变的Tyr进行基于ssODN的基因校正（KI）

以上所有数据和图片均来自Successful production of genome-edited rats by the rGONAD method

在该研究中，作者及其同事证明了rGONAD方法在WKY大鼠基因敲除和敲入实验中的高效性，稳定遗传性，以及适用于所有大鼠品系，为大鼠基因工程实验的开展提供了便利。在以后的研究中，rGONAD方法提供的基因编辑大鼠，可用于多种实验，如WKY用于新月体肾炎，F344用于神经发生，SHR用于高血压。

同时，也相信GONAD方法可以很容易地应用于哺乳动物，例如豚鼠、仓鼠、牛、猪和其它哺乳动物上。

GONAD方法优势

1. 不需复杂且昂贵的显微操作设备，且不依赖熟练的操作技能；

2. 保留雌/雄性动物完整的生殖功能，可重复使用

3. 不需安乐死雌性动物，符合动物福利3R原则

4. 只需传统方法40%的动物或更少

5. 流程简单，操作时间短，经济高效

6.适用于哺乳动物，尤其是无法收集受精卵的稀有/有价值动物或尚未建立体外收集受精卵的动物。

GONAD方法部分新进展

2019年，Satoru iwata等人用i-GONAD方法实现了小鼠4.54Mb大小的染色体倒位[5]。Takayuki Koyano等人通过i-GONAD方法构建了p21缺陷小鼠，验证p21缺乏会加重损伤早期的肾纤维化[6]。

2020年，Masahiro Sato等人扩大i-GONAD技术的适用性，两次间隔1天对B6C3F1雌性小鼠进行i-GONAD操作（si-GONAD），发现si-GONAD方法对B6C3F1雌性小鼠早期胚胎（从受精卵到桑椹胚阶段）的发育没有危害，并验证可能有助于提高indels的成功率[7]

NEPA21仪器

电转染仪

NEPA21 电转染仪采用全新设计的电转程序，特别适用于难转染细胞、离体组织或动物活体的转染。配合独有的电压衰减（Voltage/Decay）设计。

NEPA21可在获得高转染效率的同时，提高细胞存活率。专门针对难转染的原代免疫细胞、干细胞、神经细胞、活体动物、受精卵及宫内胚胎等转染，多篇文献支持，是Crisper/Cas-9 基因编辑中常用电转系统！

公司介绍

华粤企业集团旗下艾贝泰生物技术有限公司细胞医学部根据细胞存储、细胞治疗技术研发、应用研究等不同领域的特点，推出针对性应用技术的细胞治疗平台产品链。

参考资料：

1.Ohtsuka M, Sato M, Miura H, Takabayashi S, Matsuyama M, Koyano T, Arifin N, Nakamura S, Wada K, Gurumurthy CB. I-GONAD: a robust method for in situ germline genome engineering using CRISPR nucleases. Genome Biol. 2018, 19, 25.

2. Takabayashi, S.; Aoshima, T.; Kabashima, K.; Aoto, K.; Ohtsuka, M.; Sato, M. i-GONAD (improved genome-editing via oviductal nucleic acids delivery), a convenient in vivo tool to produce genome-edited rats. Sci. Rep. 2018, 8, 12059.

3.Kobayashi, T.; Namba, M.; Koyano, T.; Fukushima, M.; Sato, M.; Ohtsuka, M.; Matsuyama, M. Successful production of genome-edited rats by the rGONAD method. BMC Biotechnol. 2018, 18, 19. 

4. Iwata, S.; Nakadai, H.; Fukushi, D.; Jose, M.; Nagahara, M.; Iwamoto, T.Simple and large-scale chromosomal engineering of mouse zygotes via in vitro and in vivo electroporation. Scientific Reports. 2019, 9, 14713.

5. Koyano, T.; Namba, M.; Kobayashi, T.; Nakakuni, K;Nakano, D.; Fukushima, M.; Nishiyama, A.; Matsuyama, M.The p21 dependent G2 arrest of the cell cycle in epithelial tubular cells links to the early stage of renal fibrosis. bioRxiv. 2019

6. Sato, M.; Miyagasako, R.; Takabayashi, S.; Ohtsuka, M.; Hatada, I.; Horii, T.Sequential i-GONAD: An Improved In Vivo Technique for CRISPR/Cas9-Based Genetic Manipulations in Mice. Cell. 2020, 9, 546.

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