2022年5月26日/医麦客--星耀研究院新闻 PharmaBIGStar News/--故事的小黄花从首批接受CAR-T治疗的Emily Whitehead说起。这个漂亮的女孩儿至今已10年无癌，激励了一众血液恶性肿瘤患者，与CAR-T一起成为大众心目中的“抗癌英雄”。至今CAR-T疗法的革新还在继续，创新方案层出不穷。作为本系列的开篇，本文以近十年CAR-T发展里程碑事件为背景，梳理历代CAR结构特征所解决的临床问题作主线，还原一个真实世界的CAR-T疗法。
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创新大多来自深耕后的灵光一闪，Steven A. Rosenberg博士通过观察肿瘤浸润免疫细胞群特征，加之过往研究对IL-12可体外扩增T细胞的描述，开创了过继性T细胞疗法，用患者来源T细胞体外扩增并回输的方法对抗肿瘤，这也是CAR-T疗法的方法学雏形。二十年后，当时还是小伙子的CAR-T之父Zelig Eshhar博士带来了可实现CAR-T疗法的原型概念及关键技术。通过合作，他们共同创造了单链抗体片段（scFv），由此片段验证并构建了最初的嵌合抗原受体（CAR）。CAR按所处细胞膜位置不同，主要分为三个区域：胞外结构域、跨膜结构域及胞内结构域，嵌合抗原受体T细胞疗法（CAR-T）既是CAR和T细胞的结合。
▲ CAR的典型结构
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在CAR-T结构和作用机制逐渐明晰后，共刺激域的选择也曾影响药品上市速度，最经典的案例来自诺华的Kymriah（CD137/4-1BB）和 Kite Pharma的Yescarta(CD28)，这两款药物几乎同时进入了临床研发阶段。最终Kymriah凭借多中心Ⅱ期JULIET研究对复发及难治性弥漫大B细胞淋巴瘤成年患者的有效性及安全性数据，获得了FDA突破性疗法资格及优先评审资格，而Yescarta错失了成为“首款上市CAR-T疗法”的机会。具体来说，CD28比CD137（4-1BB）活化信号传递更强，T细胞可在短时内达到很高杀伤活性，CD137（4-1BB）的活化信号则更温和持久，这是“快”与“稳”的抉择。从近期ASH年会上，2款药品公布的临床试验数据来看，Kymriah与Yescarta在大B细胞淋巴瘤(LBCL)领域的竞争还在继续。所谓成也萧何败也萧何，各时期CAR-T疗法的应用与创新均源自CAR的结构，目前对临床疗效有影响的CAR结构具体如下：1.诱发/加速T细胞耗竭：①与间隔域（铰链区）中抗原结合位点与靶细胞膜表面TAA的距离可直接影响结合能力，导致T细胞活化受限；②具有CD8α跨膜结构域和铰链区的CAR-T细胞释放的TNF和IFNγ的数量减少，对激活诱导细胞死亡（AICD）的敏感性降低。2.影响T细胞活化：信号转导域分子选择会导致T细胞活化效率及分化改变，Alex Salter等通过淋巴瘤小鼠比较CD28与4-1BB在转导效率方面的差异时发现，CD28较4-1BB显示出更快更强的激活能力，4-1BB则具有更强的肿瘤杀灭功能，采用这一结构的CAR-T细胞与T细胞记忆相关的基因的更高表达，主要介导中枢记忆T细胞分化，显示出增加的线粒体生物生成和氧化代谢，并可产生长期存活时间及免疫应答的T细胞。3.降低对靶细胞特异性识别：胞外结构域中对抗体的选择，并不是所有抗体均能构建为抗原识别结构域，且构建后抗体的抗原结合能力会下降，这将导致CAR-T特异性结合能力下降，甚至介导膜表面无效表达。4.基因突变对疗效的影响：此前有研究证明，干扰甲基胞嘧啶双加氧酶（TET2）基因表达可增强CAR-T细胞功能，具有TET2基因突变的CAR-T细胞增殖速度放缓，抑制其表达可增加抗白血病疗效。5.对CAR结构稳定性的影响：跨膜结构域可影响CAR的表达量和稳定性，其中CD3ζ跨膜结构域可促进CAR介导的T细胞激活，进而导致细胞因子释放并诱导细胞毒性。CAR-T疗法取得的成就令人瞩目，在对抗血液肿瘤时有非常好的治疗效果，除销售额维持良好增长率外，也在全球多国相继获批上市，有些甚至进入了医保范畴。和小分子及抗体药物相比，CAR-T疗法尚处弱冠年华，富有朝气也有干劲。目前CAR-T遇到的几个问题来自价格、安全性、稳定疗效及攻克实体肿瘤方面。CAR-T疗法革新的意义就是对上述缺憾的回应，目前主要通过改进CAR的胞内结构域解决这些问题。本篇按CAR-T细胞疗法的发展历程，将CAR-T疗法划分CAR-T雏形期、应用期、改进期及通用期。CAR-T雏形期：态度很好，能力不强的初期探索阶段。
结构特点：由可识别TAA的抗原识别结构域、间隔域（铰链区）、跨膜结构域及信号转导域组成，无共刺激域。临床应用：这一时期的CAR-T结构虽然具有激活T细胞的特点，可是胞内结构域只含有激活受体CD3-ζ，无共刺激域，导致T细胞活化受限，细胞因子分泌水平较低，在体内的持续扩增有限，不具备大规模杀灭肿瘤细胞的能力。具体来说，初始T细胞激活需要TCR传导刺激信号至细胞核，经TCR/MHC通路完成，这方面可由CD3-ζ介导完成。但缺乏共刺激域就后，初始T细胞表面CD28与树突状细胞或靶细胞表面的B7无法集合产生共刺激信号，这导致CAR-T衰竭较快，无法持续产生免疫应答。代表产品：Zelig Eshhar教授通过scFv修饰的T细胞：T-bodies。CAR-T应用期：稳定了！可以造福患者了！实体肿瘤也迎来福音！
结构特点：应用期的CAR-T包含胞外结构域、跨膜结构域、并在雏形结构的基础上，在胞内结构域中增加了一个或多个共刺激域（CD28/CD137（4-1BB）/OX40/ICOS），以期提高T细胞增殖效率、细胞因子释放、并减少T细胞衰竭。其中，含有CD28或CD137（4-1BB）共刺激域的CAR是迄今为止应用最广泛的。胞外结构域的抗原识别结构域与靶抗原结合后，可使T细胞同时获得抗体刺激信号及共刺激信号，比雏形期CAR-T的活化能力提升了数倍，在结构被革新后，其临床疗效也令人欣喜。临床应用：受限于转染载体，导入T细胞的基因片段有限，导致泛用期CAR-T对共刺激域经常面临两难的选择，是选择CD28让T细胞短时间内达到杀伤活性，还是选择CD137（4-1BB）让免疫应答更为长久。所幸的是后期经过制备工艺改良，采用了慢病毒作为转染载体，扩大了可携带基因片段的范围，放宽了对共刺激域的选择限制，可选择及组合的共刺激域增加也能覆盖更多疾病。理论上共刺激域增加会产生更强的T细胞活化效率及杀伤能力，但学界对多个共刺激域是否会带来“疗效加倍”的质疑从未中断，有研究表明多共刺激域CAR-T细胞杀伤活性并没有获得明显的提升，T淋巴细胞活化信号的阈值或许有上限，单纯在数量上添加共刺激域不会再进一步提升CAR对T淋巴细胞的活化效率。总体来说，应用期CAR-T已经具备了完整结构和功能，获益于规模化和生产工艺革新，这一时期的CAR-T是最先走向市场的，也是目前多数产品的主要结构。代表药物：2017年，美国FDA批准全球第一款CAR-T细胞疗法诺华的Kymriah，适用于复发性、难治型以及青少年B细胞急性淋巴性白血病(ALL)。目前国内有两款上市产品，来自复星凯特的阿基伦赛和药明巨诺的瑞基奥仑赛。CAR-T改进期：突破肿瘤微环境抑制，继续向攻克实体肿瘤进发！
结构特点：改进期的CAR-T在雏形期及泛用期CAR-T的经验基础上，添加了促炎症细胞因子和共刺激配体，使这一时期的CAR-T具有干预肿瘤微环境、趋化其他免疫细胞的能力。常使IL-12过表达，以高效促进T细胞释放IFN-γ和穿孔素。IL-12-CAR-T在临床前动物荷瘤模型中发挥了良好的抗肿瘤效果及增殖效率，这一时期的CAR-T从结构设计开始，目标就是攻克实体肿瘤。临床应用：改进期CAR-T可在TAA刺激下释放细胞因子，募集并活化先天性免疫细胞，参与识别杀伤缺乏T细胞靶向抗原的肿瘤细胞，进而起到更广泛的抗肿瘤效应。改进期CAR-T在攻克实体肿瘤中考虑到了肿瘤异质性及肿瘤微环境的问题，具体来说，血液瘤能表达较特异的靶抗原（如CD19），实体瘤TAA在正常细胞中也有表达，造成CAR-T误杀友军，攻破了CAR-T的个性化治疗策略。改进期CAR-T是最有望打破成见，对实体肿瘤发起猛攻的CAR-T药物。代表候选管线：2022年5月9日，国际顶级期刊Nature Medicine发表了科济药业Claudin18.2 CAR-T疗法CT041治疗消化道系统肿瘤的一期临床数据。CT041的CAR结构由人源化抗CLDN18.2单链scFv、CD8α铰链区、CD28共刺激结构域和CD3ζ信号结构域组成。疗效方面，37例患者中36例存在可测量靶病灶,其中30例（83.3%）患者出现了靶病灶不同程度的缩小。客观缓解率（ORR）和疾病控制率（DCR）分别为48.6%和73.0%，中位无进展生存期（mPFS）为3.7个月，6个月时的OS率为80.1%。安全性方面，CT041首次输注后28天内未观察到剂量限制性毒性（DLT）。CAR-T通用期：降低患者获益成本，简化治疗流程！
结构特点：通用期CAR-T在结构上增加细胞质IL-2Rβ链结构域，带有STAT3/5的结合位点，该受体的抗原特异性激活同时通过CD3ζ域触发TCR、共刺激因子和细胞因子，实现“三手联弹”的协同效果。此外，相较“前辈”昂贵的个性化制备策略，通用型CAR-T更注重突破个体限制，实现规模化生产及降低成本，更强调泛用性。具体来说，通用型CAR-T使用生物素结合免疫受体（BBIR）或SUPRA等自研或合作平台，将抗原识别结构域和TCR同时激活，拓展了T细胞可识别抗原的能力。在T细胞来源方面，同种异体来源的T细胞在制备过程中，通过诸如CRISPR/Cas9等基因编辑技术破坏T细胞的TCR基因和HLA基因，以减少移植物抗宿主病 (GVHD)具有突破性。临床应用：通用型CAR-T在结构上还没被诟病，目前担忧主要来自同种异体来源的T细胞。其一是GVHD，一旦出现排斥反应，CAR-T就会被清除失效，增加患者的免疫负担；其二是异体来源的CAR-T细胞的持久性与增殖效率尚无明确报道。代表候选管线：亘喜生物靶向CD19/CD7的GC502：2022年AACR年会期间通过海报报告形式汇报临床试验进展，首次人体试验(FIH)数据，初步临床数据显示出了卓越的安全性和有效性。GC502来自于TruUCAR平台，为减少宿主抗移植物排斥反应 (HvG)，对T细胞进行了工程改造，以表达特异性靶向患者自身T细胞和自然杀伤（NK）细胞（同种异体反应性杀伤细胞）的CAR，而不影响治疗期间其他免疫细胞区室的恢复。为降低同种异体T细胞引发的移植物抗宿主病（GvHD）风险，利用CRISPR/Cas9 去破坏T细胞受体 α 恒定 (TRAC) 位点，以消除TruUCAR候选产品TCR复合物的表面表达。此外，为消除潜在的“内耗”现象（CAR-T细胞间互相杀伤），利用CRISPR/Cas9破坏了CD7(一种CAR-T细胞上表达 pan T 和 NK的标记) 。总的来说，CAR的结构是CAR-T疗法临床疗效的核心，任何进展和创新都会为此后出现的免疫细胞疗法奠定了基础。CAR-T优秀的抗肿瘤作用一直以来都是各方关注的焦点，虽然仍面临一些挑战，但相信从结构出发，基于多年历代CAR-T沉淀的宝贵经验，这些问题终将被解决！下一篇，我们将汇总整理CAR-T经典靶点及多靶点应用趋势，希望还能与你见面。