腺相关病毒AAV(一)：来时的路
2022年6月16日/医麦客--星耀研究院新闻 PharmaBIGStar News/--随着细胞和基因治疗(Cellular and Gene Therapy, CGT)临床试验的不断开展和创新性产品的陆续上市，CGT已在一些遗传病及恶性肿瘤领域取得了重大突破，为一些传统疗法无效、容易复发或难治疾病患者带来了新的希望。截至目前，全球批准上市的CGT产品有22种，包括CAR-T疗法、干细胞疗法、溶瘤病毒疗法和基因疗法。基因治疗无疑是一个备受瞩目的领域，腺相关病毒(AAV)载体疗法更是其中最重要的治疗技术之一。
基因治疗是指将外源正常基因导入到靶细胞内，纠正或置换致病基因以治疗基因缺陷或异常所引起的疾病的技术。导入的基因可以是与缺陷基因对应、在体内表达具有特异功能的同源基因，也可以是与缺陷基因无关的治疗基因。通过这种疗法，目的基因或整合到宿主细胞染色体，或游离于染色体外，在细胞中得到表达，发挥治疗疾病的作用。与常规治疗手段相比，基因治疗能从DNA源头上解决疾病的发生，从而实现单次治疗带来长期疗效。
基因治疗技术主要包括基因编辑技术和基因递送技术。对于基因突变引起的疾病，我们需要通过基因编辑手段纠正出错的基因，使其恢复到正常状态。目前主要的技术可分为锌指核酸酶(ZFNs)技术、转录激活样效应因子核酸酶(TALENs)技术和成簇规律性间隔的短回文重复序列(CRISPR/Cas)技术三大类。
而对于正常基因功能缺失疾病的治疗，最直接的方法就是利用载体将正常基因导入患者体内实现治疗作用。目前最常用的载体就是人工改造后的工程病毒，包括腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、孢疹病毒和逆转录病毒。
▲ 来源：沙利文分析
AAV是一种复制缺陷型病毒，属细小病毒家族，由单链线性病毒DNA和衣壳蛋白组成。AAV进入宿主细胞后以游离DNA的形式存在，不会引起宿主细胞基因组的插入突变，从而提高了基因治疗的安全性。此外，不同亚型的病毒对不同的组织具有不同的亲和力，具有良好的组织靶向性。AAV载体因其良好的靶向性、转导率及极低的免疫原性，被认为是最有临床应用前途的基因载体之一。
1965年AAV首次在实验室的腺病毒制剂中被发现，研究人员对AAV进行了大约25年的基础性研究。在此基础上，各实验室随后便尝试将AAV载体用于治疗人类疾病的基因治疗实验。
1995年AAV载体首次人体试验用于治疗囊性纤维化患者，随后发现了越来越多的AAV血清型家族。
1999年，患有严重遗传病鸟氨酸转氨甲酰酶缺乏症的18岁少年Jesse Gelsinger在接受Jim Wilson教授主导的腺病毒基因治疗临床实验后，发生严重免疫反应后死亡。美国FDA开始调查并严格审核基因治疗临床试验，基因疗法和载体腺病毒沉寂了很长时间。
2012年，欧盟批准了全球首款AAV基因治疗产品Glybera®，用于治疗人脂蛋白脂肪酶(LPL)缺乏。售价为121万美元。
2017年12月，美国FDA首次批准了眼科基因疗法Luxturna®，用于治疗莱伯氏先天性黑蒙症(Leber’s congenital amaurosis)及其他由RPE65基因突变引起的眼疾。注射费用为85万美元。这是美国市场第一款真正意义上的基因疗法，标志着基因治疗时代的正式来临。
一年半之后，诺华的脊髓性肌萎缩症（SMA）基因疗法Zolgensma®也获得了批准，这是目前全球最贵的药品。
基因治疗开始蓬勃发展，以腺相关病毒（AAV）为载体的基因治疗产品开始在各国大量开展科学研究和临床试验，对疾病的治疗迈入了基因时代。
AAV的生产平台主要有三种：三质粒瞬转体系、杆状病毒表达载体体系和包装细胞体系。
目前，20多年前开发的“三质粒转染”技术仍然占据腺相关病毒基因疗法的主流地位。三质粒包括腺病毒Helper质粒（包含E2a/b、E4和VARNA基因）、表达质粒（包含转基因序列，两端是ITR）以及辅助质粒（包含Cap（编码病毒衣壳蛋白）&Rep（参与病毒的复制）基因），只需要将三个质粒转染到宿主细胞（大多数情况下HEK293细胞），就可以组装成rAAV病毒颗粒。
杆状病毒表达载体体系是应用杆状病毒表达载体(BEV)系统感染昆虫细胞Sf9，是一种替代哺乳动物包装细胞系的生产方案。包装细胞体系PCL避免了多质粒转染步骤，简化了病毒载体生产步骤，极大地降低了降低成本。
AAV载体的生产流程跟抗体、疫苗类药物的生产类似，主要包含上游培养、下游纯化以及制剂部分。
开发完成并通过质量检测后，将携带有所需基因的AAV载体注射进体内。AAV载体附着于靶细胞的细胞表面受体后，通过内吞作用被内化。不同血清型的AAV感染过程中相应的细胞表面受体不尽相同，因此在体内不同的组织器官表现出不同的亲和力和感染效率。例如，O-连接的2,3-唾液酸作为AAV4的结合受体，而N-连接的唾液酸作为AAV1、AAV5和AAV6的结合受体。
细胞内吞作用将病毒通过包涵体运送到细胞核。AAV基因组在细胞核内脱壳，释放单链DNA基因组，合成第二链DNA，转化为双链DNA。ITRs结构的游离端作为DNA合成的引物。病毒DNA就此整合到宿主细胞DNA中成为亲代病毒，或以循环形式持续存在，实现基因疗法治疗目的。
约80%的罕见病都与遗传因素相关，如基因突变所导致的疾病包括镰刀型贫血症、白化病、色盲、粘多糖病等；基因缺失所导致的疾病包括地中海贫血、血友病等。AAV载体的基因疗法在这些疾病的治疗中已取得了不错的成绩，已有一些药物上市或达到临床Ⅲ期。
AAV载体的基因疗法可通过引入缺失的基因功能来治疗疾病，例如目前已有许多AAV载体的基因疗法在血友病（凝血蛋白因子VIII缺乏症）的治疗中获得突破。此外，AAV载体还可以直接引入基因，例如治疗类风湿关节炎的药物Arthrogen，该药物携带IFN-β的转基因，可表达在骨和软骨保护中起作用的抗炎介质。
AAV载体已经证明了其处于基因治疗前沿的地位，是治疗罕见病等基因疾病的希望。目前全球已有许多企业在此赛道布局，并且出现了越来越多正在进行的成功临床试验，在下篇文章中小编将为您带来详细的盘点，不见不散哦！
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