单细胞转录组探索CRC的异质性

呐，等你关注都等出蜘蛛网了~

不知不觉在单细胞转录组领域做知识分析也快两年了，很幸运聚集了五个小伙伴携手共进，我们承诺不间断更新5个月，把我们这两年的学习成果全部掏出来给大家，包括5个栏目：

1. 文献速递（简短介绍，扩充知识面）

2. 文献详解（图文并茂带来大家系统性学习）

3. R与Bioconductor的技巧（书籍翻译，妙招共享）

4. scRNAseq的GitHub的书籍翻译（原汁原味的名校教程）

5. 全网第一个单细胞转录组视频教程学习笔记分享

希望大家能有所收获！

现在你看到的是文献速递

文章信息

文章题目是：Reference component analysis of single-cell transcriptomes elucidates cellular heterogeneity in human colorectal tumors. 发表于 2017 年5月的Nature杂志。PMID: 28319088

单细胞转录组分析

单细胞转录组，使用的是GPL11154Illumina HiSeq 2000 (Homo sapiens) ，数据都上传到了：GSE81861 ；BioProject：PRJNA323703；SRA：ERP016958

既有病人的单细胞转录组数据，同时也有细胞系的数据做验证。

• 1,591 single cells from 11 colorectal cancer patients，包括 969肿瘤部位细胞以及 622 癌旁细胞。严格过滤后只剩下：375 tumor cells and 215 normal mucosa cells

• 630 single cells from 7 cell lines，过滤后剩下561个
  

• 83 A549 cells,

• 65 H1437 cells,

• 55 HCT116 cells,

• 23 IMR90 cells,

• 96 K562 cells,

• 134 GM12878 cells (38 from batch 1, 96 from batch 2)

• 174 H1 cells (96 from batch 1, 78 from batch 2).

上游测序数据没有必要重新下载分析了，可以直接使用作者上传的表达矩阵：

Supplementary fileSizeDownloadFile type/resourceGSE81861_CRC_NM_all_cells_COUNT.csv.gz3.2 Mb(ftp)(http)CSVGSE81861_CRC_NM_all_cells_FPKM.csv.gz4.7 Mb(ftp)(http)CSVGSE81861_CRC_NM_epithelial_cells_COUNT.csv.gz2.5 Mb(ftp)(http)CSVGSE81861_CRC_NM_epithelial_cells_FPKM.csv.gz4.0 Mb(ftp)(http)CSVGSE81861_CRC_tumor_all_cells_COUNT.csv.gz4.3 Mb(ftp)(http)CSVGSE81861_CRC_tumor_all_cells_FPKM.csv.gz7.9 Mb(ftp)(http)CSVGSE81861_CRC_tumor_epithelial_cells_COUNT.csv.gz3.6 Mb(ftp)(http)CSVGSE81861_CRC_tumor_epithelial_cells_FPKM.csv.gz6.5 Mb(ftp)(http)CSVGSE81861_Cell_Line_COUNT.csv.gz13.1 Mb(ftp)(http)CSVGSE81861_Cell_Line_FPKM.csv.gz28.9 Mb(ftp)(http)CSVGSE81861_GEO_EGA_ID_match.csv.gz14.4 Kb(ftp)(http)CSV

作者认为全文最重要的是开发了一个挖掘细胞类型的算法：reference component analysis (RCA) 优于其它现有的算法。可以把cancer-associated fibroblasts (CAFs)继续分成两个类别。对比的算法包括：

• hierarchical clustering using all expressed genes (All-HC)

• hierarchical clustering using principal-component analysis (PCA)-based feature selection (HiLoadG-HC)

• BackSPIN

• RaceID2

• Seurat

• three additional methods based on selection of genes with highly variable expression (VarG-HC, VarG-PCAproj-HC and VarG-tSNEproj-HC).

使用 adjusted Rand index (ARI) 指标来评价各个聚类算法的优劣。结果发现自己开发的RCA表现超常！！！

当然了，还在 Tirosh, I. et al. Dissecting the multicellular ecosystem of metastatic melanoma by single-cell RNA–seq. Science 352, 189–196 (2016). 文章的数据里面做了验证。

背景知识

肿瘤异质性很重要，单细胞转录组测序很厉害，以前的研究根据单细胞转录组表达矩阵进行分类的算法不够好，所以他们开发reference component analysis (RCA) ， 而且 Colorectal cancer (CRC) 疾病非常严重，需要探索。

根据细胞系单细胞表达数据探索算法

630个细胞的表达数据，过滤后剩下561个，这里使用Fragments per kilobase per million reads (FPKM)来进行表达定量。因为其上游处理走的是TOPHAT2+CUFFLINKS流程。

单细胞过滤策略

rate of exonic reads (ROER) 需要大于5%

number of detected genes (NODG) 需要大于1000， 基因的FPKM ≥1才能算被检测到了。

Exonic reads (ER) 要大于0.1Million

管家基因: TFRC, ACTB, RPLP0, PGK1, GAPDH, LDHA, NONO, B2M, GUSB and PPIH.

RCA算法细节

首先从 BioGPS数据库里面下载两个数据集：HumanU133A/GNF1H Gene Atlas and the Primary Cell Atlas ，从中挑选 A total of 4,717 genes were selected as features for GNF1H and 5,209 genes were selected for the Primary Cell Atlas. 还使用了 WGCNA 算法。

还使用了一些其它公共数据：TCGA, GSE14333, the PRECOG database, and GSE33113, GSE37892 and GSE39582 来验证单细胞转录组得到的基因集（The 'fibroblast-like' signature ）是否能显著的区分CRC病人的生存情况。

需要了解一些细胞类型的 known markers

• epithelial cells (VIL1, KRT20, CLDN7, CDH1)

• endothelial cells (Endo; ENG)

• fibroblasts (Fibro; SPARC, COL14A, COL3A1, DCN)

• B cells (CD38, MZB1, DERL3)

• T cells (TRBC2, CD3D, CD3E, CD3G)

• myeloid cells (ITGAX, CD68, CD14, CCL3)

• mast cells (KIT, TPSB2)

做成了一个R包供使用：RCA R package, github.com/GIS-SP-Group.

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