单细胞转录组探索急性髓系白血病

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文章信息

今天给大家介绍的文章利用单细胞转录组联合突变分析研究急性髓性白血病（AML），揭示AML病人体内存在不同功能子集及其相关的驱动因子。于2019年3月7日发表在Cell 杂志。文章标题是：Single-Cell RNA-Seq Reveals acute myeloid leukemia Hierarchies Relevant to Disease Progression and Immunity

  摘要   

急性髓性白血病（AML）是一种异质性疾病，存在于复杂的微环境中，并使了解不同细胞类型如何促进该疾病的进展变得困难。 我们将单细胞转录组和单细胞基因分型结合起来，分析来自40个骨髓穿刺（包含16个AML患者和5个健康供体）的38410个细胞。然后，应用机器学习区分一系列的恶性细胞类型的在不同患者之间和同一种肿瘤不同患者亚克隆中的丰度变化。细胞类型组成与原型遗传病变相关，包括FLT3-ITD与丰富的祖细胞样细胞的关联。原代AML细胞在干细胞和髓系基因共表达的情况下，表现出转录调控失调，并具有预后意义。体外实验显示，分化的单核细胞样AML细胞表达多种免疫调节基因，并抑制T细胞活性。综上所述，我们提供的单细胞技术和关于AML细胞状态、调节因子和标记物的图谱，对精准医疗和免疫疗法都具有一定的指导意义。

 测序数据介绍   

采用Seq-Well高通量单细胞测序技术，对10000 个CD34+（阳性）细胞和10000 个CD34+CD38– 细胞进行Seq-well单细胞测序。这些细胞来自正常的骨髓捐献者和AML病人患者，通过流式细胞仪分选获得。

 数据分析情况   

• 数据过滤：统计每个文库数据所有独特的12 bp的cell barcodes(CBs),排除出现次数小于100次的CBs，并过滤掉CBs包含八个相同核苷酸的片段。然后，排除CBs相关的随机UMI(随机相关定义为任何一个碱基的UMI不超过90%)

• 比对: hg38 genome使用STAR(2.5.3)软件

• 基因定量：对转录本使用“-‘‘–quantMode TranscriptomeSAM”进行定量。生成包含每个细胞和每个基因的UMI数量的表达矩阵。

• 细胞过滤：下游分析的要求细胞至少具有1,000个UMIs比对到至少500个独特基因。我们还排除了含有超过20％线粒体或者核糖体基因的细胞。

• 聚类分析：质控后获得7698个正常的骨髓细胞（normal BM）。随机过滤掉BM5 CD38+CD38-的1590个细胞中的783个细胞,来降低CD38+CD38-细胞对细胞群体的代表性。剩余的6915个正常的骨髓细胞被用来聚类形成细胞类型使用BackSPIN无监督进行细胞类型聚类。BackSPIN clustering (优点：可以克服细胞和基因同时聚类的困难).

• 可视化：使用KNN和t-SNE两种方法对细胞进行可视化分析。

• 表达矩阵可以下载：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE116256

 主要分群情况   

 识别正常骨髓样品种的细胞类群

从正常的骨髓穿刺捐献者的样本获得7689个细胞的高质量的数据。细胞聚类建立造血标记的细胞群体，诸如，含有CD34标记的HSC/Prog细胞，含有CD14标记的单核细胞和含有CD3标记的T细胞。使我们能够将31个聚类合并为15种主要的细胞类群。

随后，使用可视化K-最近邻（KNN）图来探索这些细胞类型之间的关系，这些图将数据集中的所有单个细胞连接到基因表达空间中的五个最近邻的细胞（Weinreb等，2018）。揭示了假定的细胞分化轨迹，包括从HSC到具有几种中间状态和基因表达梯度的单核细胞的连续细胞分化的连续性（图1D和S1E-S1G）。本研究的细胞类型注释与最近的单细胞转录研究公布的数据结果一致。正常BM细胞的单细胞转录组揭示了造血细胞类型的多样性和当前造血细胞分化轨迹观点的一致性。

 AML肿瘤生态系统的单细胞分析

为了检测AML的细胞类型的多样性，本研究中使用了16名AML患者在诊断和治疗期间获得了35份冷冻保存的骨髓穿刺样品（图2a）；该队列包含多个世卫组织描述的亚型和遗传多样性（年龄26-74）。对研究的所有队列中的样品进行靶向DNA测序显示，预期的突变频率，包括DNMT3A（44％的患者），FLT3（31％）和NPM1（31％;图2B）（Cancer Genome Atlas Research等，2013）。为了使对AML肿瘤微生态系统的概述具有更高的代表性，我们没有对35个样本得单细胞转录组数据进行富集。

虽然其他细胞群也表达与特定造血细胞类型相关的标志物，但它们的正常或恶性特征不能与其表达程序先验地区分。因此，我们探索了区分恶性AML细胞的其他方法。

采用t分布随机邻域重建（t-SNE）方法，获得30712个高质量的转录组和可视化的细胞。这显示出不同的细胞类型，其比例在临床过程中发生了显著变化(图2C和2D)。除了恶性细胞外，结果还显示了肿瘤生态系统中假定的正常造血细胞类型，这些类型的细胞表达了特异性基因，如血红蛋白（红细胞）和CD3（T细胞）。收集诱导化疗后采集的样本中主要是T细胞/自然杀伤细胞（NK），这与SML母细胞清除及其组织学染色显示的结果一致。尽管其他细胞群，也会表达与特定造血细胞类型相关的标记物，但是对正常或者恶性特征的识别并不能预先区分出来。因此，下文探讨了鉴别恶性AML细胞的方法。

 临床意义   

我们利用单细胞转录组学和基因分型的创新来分析异质性AML生态系统。我们的研究结果提供了对原始AML细胞异常调控程序的深入了解，揭示了发育层次与肿瘤遗传学之间的显著对应关系，并鉴定了具有免疫抑制特性的分化AML细胞。我们的数据和发现可以指导治疗策略以针对恶性肿瘤的关键和特定成分。

转录组学和基因分型分析异质性AML生态系统。我们的研究结果提供了对原始AML细胞异常调控程序的深入了解，揭示了发育层次与肿瘤遗传学之间的显著对应关系，并鉴定了具有免疫抑制特性的分化AML细胞。我们的数据和发现可以指导治疗策略以针对恶性肿瘤的关键和特定成分。

本研究利用单细胞转录组学和单细胞基因分型技术创造性地，来分析AML生存微环境的异质性。研究结果对原始AML细胞异常调控程序的深入了解，揭示了发育层次与肿瘤遗传学之间的显著对应关系，并鉴别出具有免疫抑制性的AML细胞。本研究的数据和结果，可以指导针对恶性肿瘤的治疗策略-通过靶向重要的和特异性的恶性肿瘤的组分。

(注：本文小编仅仅关注单细胞转录组，原文的单细胞基因分型也很有意义)

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