scRNA包学习Monocle2

课程笔记

粉丝：有单细胞线上课程吗？

小编：什么？ 我们的单细胞转录组分析线上课程已经上线好久了，你们竟然都不知道吗，每篇推文后面的课程推荐没人看的吗，小编已哭晕在厕所

好了，戏演完了，下面郑重介绍下我们的单细胞线上课程：（详情戳下方链接） 

这个课程笔记栏目记录了学员们学习单细胞转录组课程的学习笔记

希望大家能有所收获！

目录

前言

第三单元第七讲：使用scRNA包学习Monocle2

课程链接在：http://jm.grazy.cn/index/mulitcourse/detail.html?cid=53

关于monocle2

目前monocle2可以直接利用Bioconductor安装：https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/monocle.html

1if (!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE))
2    install.packages("BiocManager")
3
4BiocManager::install("monocle")
5# 安装的版本是2.12.0

关于这个scRNA包

内容在：https://github.com/jmzeng1314/scRNA_smart_seq2/blob/master/scRNA/study_scRNAseq.html

要使用scRNAseq这个R包，首先要对它进行了解，包中内置了Pollen et al. 2014 的数据集（https://www.nature.com/articles/nbt.2967），到19年8月为止，已经有446引用量了。只不过原文完整的数据是 23730 个基因， 301 个样本【这里只有130个样本文库(高覆盖度、低覆盖度各65个，并且测序深度不同】，这个包中只选取了4种细胞类型：pluripotent stem cells 分化而成的 neural progenitor cells (NPC，神经前体细胞) ，还有 GW16（radial glia，放射状胶质细胞） 、GW21（newborn neuron，新生儿神经元） 、GW21+3(maturing neuron，成熟神经元) ，它们的关系如下图（NPC和其他三类存在较大差别）：

数据大小是50.6 MB，要想知道数据怎么处理的，可以看：https://hemberg-lab.github.io/scRNA.seq.datasets/human/tissues/

加载scRNA包中的数据

 1library(scRNAseq)
 2data(fluidigm)
 3
 4> fluidigm
 5class: SummarizedExperiment 
 6dim: 26255 130 
 7metadata(3): sample_info clusters which_qc
 8assays(4): tophat_counts cufflinks_fpkm rsem_counts rsem_tpm
 9rownames(26255): A1BG A1BG-AS1 ... ZZEF1 ZZZ3
10rowData names(0):
11colnames(130): SRR1275356 SRR1274090 ... SRR1275366 SRR1275261
12colData names(28): NREADS NALIGNED ... Cluster1 Cluster2

创建CellDataSet对象

=> newCellDataSet()

 1# 这个对象需要三个要素
 2# 第一个：RSEM表达矩阵（ct = count）
 3assay(fluidigm)  <-  assays(fluidigm)$rsem_counts
 4ct <- floor(assays(fluidigm)$rsem_counts)
 5ct[1:4,1:4] 
 6# 第二个：临床信息
 7sample_ann <- as.data.frame(colData(fluidigm))
 8# 第三个：基因注释信息（必须包含一列是gene_short_name）
 9gene_ann <- data.frame(
10  gene_short_name = row.names(ct), 
11  row.names = row.names(ct)
12)
13# 然后转换为AnnotatedDataFrame对象
14pd <- new("AnnotatedDataFrame",
15          data=sample_ann)
16fd <- new("AnnotatedDataFrame",
17          data=gene_ann)
18
19# 最后构建CDS对象
20sc_cds <- newCellDataSet(
21  ct, 
22  phenoData = pd,
23  featureData =fd,
24  expressionFamily = negbinomial.size(),
25  lowerDetectionLimit=1)
26sc_cds
27# CellDataSet (storageMode: environment)
28# assayData: 26255 features, 130 samples 
29# element names: exprs 
30# protocolData: none
31# phenoData
32# sampleNames: SRR1275356 SRR1274090 ... SRR1275261 (130 total)
33# varLabels: NREADS NALIGNED ... Size_Factor (29 total)
34# varMetadata: labelDescription
35# featureData
36# featureNames: A1BG A1BG-AS1 ... ZZZ3 (26255 total)
37# fvarLabels: gene_short_name
38# fvarMetadata: labelDescription
39# experimentData: use 'experimentData(object)'
40# Annotation:  

注意到构建CDS对象过程中有一个参数是：expressionFamily ，它是选择了一个数据分布，例如FPKM/TPM 值是log-正态分布的；UMIs和原始count值用负二项分布模拟的效果更好。负二项分布有两种方法，这里选用了negbinomial.size，另外一种negbinomial稍微更准确一点，但速度大打折扣，它主要针对非常小的数据集

质控过滤

=> detectGenes()

 1cds=sc_cds
 2cds ## 原始数据有：26255 features, 130 samples
 3# 设置一个基因表达量的过滤阈值，结果会在cds@featureData@data中新增一列num_cells_expressed，记录这个基因在多少细胞中有表达
 4cds <- detectGenes(cds, min_expr = 0.1)
 5# 结果保存在cds@featureData@data
 6print(head(cds@featureData@data))
 7# gene_short_name num_cells_expressed
 8# A1BG                A1BG                  10
 9# A1BG-AS1        A1BG-AS1                   2
10# A1CF                A1CF                   1
11# A2M                  A2M                  21
12# A2M-AS1          A2M-AS1                   3
13# A2ML1              A2ML1                   9

在monocle版本2.12.0中，取消了fData函数（此前在2.10版本中还存在），不过在monocle3中又加了回来

如果遇到不能使用fData的情况，就可以采用备选方案：cds@featureData@data

然后可以进行基因过滤 =>subset()

1expressed_genes <- row.names(subset(cds@featureData@data,
2                                    num_cells_expressed >= 5))
3length(expressed_genes)
4## [1] 13385
5cds <- cds[expressed_genes,]

还可以进行细胞层面的过滤（可选）

 1# 依然是：如果不支持使用pData()函数，可以使用cds@phenoData@data来获得各种细胞注释信息
 2print(head(cds@phenoData@data))
 3# 比如我们看一下细胞注释的第一个NREADS信息
 4tmp=pData(cds)
 5fivenum(tmp[,1])
 6## [1]    91616   232899   892209  8130850 14477100
 7
 8# 如果要过滤细胞，其实也是利用subset函数，不过这里不会对细胞过滤
 9valid_cells <- row.names(cds@phenoData@data)
10cds <- cds[,valid_cells]
11cds 
12## CellDataSet (storageMode: environment)
13## assayData: 13385 features, 130 samples 
14##   element names: exprs 
15## protocolData: none
16## phenoData
17##   sampleNames: SRR1275356 SRR1274090 ... SRR1275261 (130 total)
18##   varLabels: NREADS NALIGNED ... num_genes_expressed (30 total)
19##   varMetadata: labelDescription
20## featureData
21##   featureNames: A1BG A2M ... ZZZ3 (13385 total)
22##   fvarLabels: gene_short_name num_cells_expressed
23##   fvarMetadata: labelDescription
24## experimentData: use 'experimentData(object)'
25## Annotation:

聚类

在monocle3中，聚类使用的是cluster_cells() ，利用Louvain community detection的非监督聚类方法，结果保存在cds@clusters$UMAP$clusters

不使用marker基因聚类

使用函数clusterCells()，根据整体的表达量对细胞进行分组。例如，细胞表达了大量的与成肌细胞相关的基因，但就是没有成肌细胞的marker--MYF5 ，我们依然可以判断这个细胞属于成肌细胞。

step1：dispersionTable()

首先就是判断使用哪些基因进行细胞分群。当然，可以使用全部基因，但这会掺杂很多表达量不高而检测不出来的基因，反而会增加噪音。挑有差异的，挑表达量不太低的

1cds <- estimateSizeFactors(cds)
2cds <- estimateDispersions(cds)
3disp_table <- dispersionTable(cds) # 挑有差异的
4unsup_clustering_genes <- subset(disp_table, mean_expression >= 0.1) # 挑表达量不太低的
5cds <- setOrderingFilter(cds, unsup_clustering_genes$gene_id)  # 准备聚类基因名单
6plot_ordering_genes(cds) 
7# 图中黑色的点就是被标记出来一会要进行聚类的基因

step2：plot_pc_variance_explained()

然后选一下主成分

1plot_pc_variance_explained(cds, return_all = F) # norm_method='log'

step3:

根据上面👆的图，选择合适的主成分数量（这个很主观，可以多试几次），这里选前6个成分（大概在第一个拐点处）

1# 进行降维
2cds <- reduceDimension(cds, max_components = 2, num_dim = 6,
3                        reduction_method = 'tSNE', verbose = T)
4# 进行聚类
5cds <- clusterCells(cds, num_clusters = 4) 
6# Distance cutoff calculated to 0.5225779 
7plot_cell_clusters(cds, 1, 2, color = "Biological_Condition")

1> table(cds@phenoData@data$Biological_Condition)
2
3  GW16   GW21 GW21+3    NPC 
4    52     16     32     30 

需要注意的是，使用的主成分数量会影响结果

前面使用了6个主成分，分的还不错。现在假设使用前16个主成分：

1cds <- reduceDimension(cds, max_components = 2, num_dim = 16,
2                       reduction_method = 'tSNE', verbose = T)
3cds <- clusterCells(cds, num_clusters = 4) 
4plot_cell_clusters(cds, 1, 2, color = "Biological_Condition")

错误示范

以下是测试代码！

除此以外，如果有批次效应等干扰因素，也可以在降维（reduceDimension()）的过程中进行排除：

1if(F){
2  cds <- reduceDimension(cds, max_components = 2, num_dim = 6,
3                         reduction_method = 'tSNE',
4                         residualModelFormulaStr = "~Biological_Condition + num_genes_expressed",
5                         verbose = T)
6  cds <- clusterCells(cds, num_clusters = 4)
7  plot_cell_clusters(cds, 1, 2, color = "Biological_Condition")
8}
9# 可以看到，去掉本来的生物学意义后，最后细胞是会被打散的。所以residualModelFormulaStr这个东西的目的就是磨平它参数包含的差异

但是，如果是去除其他的效应：

1# 如果去除生物意义以外的效应
2  cds <- reduceDimension(cds, max_components = 2, num_dim = 6,
3                         reduction_method = 'tSNE',
4                         residualModelFormulaStr = "~NREADS + num_genes_expressed",
5                         verbose = T)
6  cds <- clusterCells(cds, num_clusters = 4)
7  plot_cell_clusters(cds, 1, 2, color = "Biological_Condition")

关于处理批次效应：例如在芯片数据中经常会利用SVA的combat函数。
磨平批次效应实际上就是去掉各个组的前几个主成分

差异分析

=> differentialGeneTest()

1start=Sys.time()
2diff_test_res <- differentialGeneTest(cds,
3                                      fullModelFormulaStr = "~Biological_Condition")
4end=Sys.time()
5end-start
6# 运行时间在几分钟至十几分钟不等

然后得到差异基因

1sig_genes <- subset(diff_test_res, qval < 0.1)
2> head(sig_genes[,c("gene_short_name", "pval", "qval")] )
3      gene_short_name         pval         qval
4A1BG             A1BG 4.112065e-04 1.460722e-03
5A2M               A2M 4.251744e-08 4.266086e-07
6AACS             AACS 2.881832e-03 8.275761e-03
7AADAT           AADAT 1.069794e-02 2.621123e-02
8AAGAB           AAGAB 1.156771e-07 1.021331e-06
9AAMP             AAMP 7.626789e-05 3.243869e-04

作图（注意要将基因名变成character）

 1cg=as.character(head(sig_genes$gene_short_name))
 2# 普通图
 3plot_genes_jitter(cds[cg,], 
 4                  grouping = "Biological_Condition", ncol= 2)
 5# 还能上色
 6plot_genes_jitter(cds[cg,],
 7                  grouping = "Biological_Condition",
 8                  color_by = "Biological_Condition",
 9                  nrow= 3,
10                  ncol = NULL )

我们自己也可以根据某个基因的表达量差异和分组信息进行作图（就以A1BG为例）：

1# 以A1BG为例
2boxplot(log10(cds@assayData$exprs["A1BG",]+1) ~ cds@phenoData@data$Biological_Condition)

推断发育轨迹

三步走：从差异分析结果选合适基因=》降维=》细胞排序

step1: 选合适基因

1ordering_genes <- row.names (subset(diff_test_res, qval < 0.01))
2cds <- setOrderingFilter(cds, ordering_genes)
3plot_ordering_genes(cds)

step2: 降维

1# 默认使用DDRTree的方法 
2cds <- reduceDimension(cds, max_components = 2,
3                            method = 'DDRTree')

step3: 细胞排序

1cds <- orderCells(cds)

最后可视化

1plot_cell_trajectory(cds, color_by = "Biological_Condition")  

这个图就可以看到细胞的发展过程

另外，plot_genes_in_pseudotime 可以对基因在不同细胞中的表达量变化进行绘图

1plot_genes_in_pseudotime(cds[cg,],
2                         color_by = "Biological_Condition")

“

如果你对单细胞转录组研究感兴趣，但又不知道如何入门，也许你可以关注一下下面的课程

”