JACS：筛选特异性抑制自噬途径的小分子抑制剂

▉  原文信息

▉  作者简介

今天给大家带来一篇最近发表在 J.Am.Chem.Soc (IF=14.695) 上面的文章。文章通讯作者是来自于芝加哥伊利诺伊大学化学系助理教授 Leslie N.Aldrich.主要通过有机合成和化学生物学研究疾病的分子机理。图片来源于参考资料1

▉  导读

1. 今天带给大家的文献是如何筛选小分子去调控蛋白-蛋白相互作用。我们都知道蛋白质相互作用的界面大小约数千平方埃，一般需要大分子结构才能契合，而这些大分子相对于小分子来说优化较为困难，体内活性较差。目前也有针对蛋白相互作用开发出来的小分子抑制剂，比如 BCL-2 和 MDM2 抑制剂，但并不多见。 

2. 最近的研究表明，蛋白与蛋白作用界面一般具有关键的二级结构特性,比如α-螺旋或coiled-coil结构域（可复习前期正交coiled-coil蛋白相互作用工具包大显神通）。靶向这样的界面其实对小分子来说并不困难，因为相互作用界面的关键残基往往聚集在一个单一的螺旋面上。3. 这篇文章的应用是细胞自噬。该过程是所有真核生物中一个进化保守的分解代谢过程，胞质物质被吞噬、降解和循环。一般在营养丰富的条件下，自噬很少启动。但当营养被剥夺、能量消耗或细胞应激反应时发生。在激发过程中，细胞内受损的细胞器，蛋白质以及病原体等被隔离在一个叫做自噬小体的双膜囊中，然后被转运到溶酶体进行降解。

▉ 前言

1. 目前在自噬通路抑制方面存在较大的争议。目前为止仍然没有特异性抑制自噬通路的小分子抑制剂。

2.如上图所示引发自噬的过程需要通过形成VPS34复合物I（VPS15-VPS34-ATG14L-Beclin 1）（字体颜色对应上图，本来不想用这么多颜色，为了和图片对应，易于理解），但是其中的三个蛋白区域VPS15-VPS34-Beclin1也会和 UVRAG 结合形成 VPS34 复合物II，而这个复合物的形成会引发囊泡运输。目前的一些抑制剂一般是针对 VPS34 蛋白，比如 PIK-III 和 SAR405。这就有点尴尬了，这些抑制剂不能选择性的抑制VPS34复合物I中的 VPS34 蛋白去引发自噬，也会抑制VPS34复合物II中的 VPS34 蛋白去引发囊泡运输。这样会极大的扰乱我们想单独研究自噬对于细胞生理作用影响。3. 作者发现VPS34复合物I中 ATG14L-Beclin1 相互作用，而在 VPS34 复合物II中 UVRAG-Beclin 1 相互作用，针对 ATG14L-Beclin1 相互作用，作者通过高通量筛选得到目标小分子 19，填补了目前尚未有特异抑制细胞自噬的空白。

▉ 内容

a| 利用NanoBRET技术进行高通量筛选得到候选化合物

原理：

NanoLucluciferase作为能量供体融合表达在 ATG14L 末端和 HaloTag蛋白标记的NanoBRET™618 荧光基团作为受体融合表达在 VPS34 末端（质粒系统）。来自NanoLuc供体的明亮的蓝移发光信号耦合到远红移的HaloTag受体上后，光谱叠加，输出荧光信号。如果此时有小分子抑制了两个蛋白相互作用，荧光便会消失。文章正是采用该技术，在真核细胞里于2560 个潜在作用的小分子库里筛选到了19个具有活性的化合物。图片来源于参考资料2

b| 自噬抑制的效率实验设计

作者既然已经找到候选活性小分子，那么如何才能验证这些小分子在真核细胞里面抑制自噬的效率？那这里有两个小背景知识：（1）VPS34 是一个脂激酶，可催化磷脂酰肌醇（PI）磷酸化生成磷脂酰肌醇-3-磷酸（PI3P）。PI3P生成早期的自噬体和早期的内体。自噬受到抑制时，自噬体（图中autophagosome）生成减少。（2）LC3 是自噬标志物，通过表达 eGFP-LC3，自噬形成时，会结合到自噬体上，聚集产生绿色荧光斑点；当自噬受到抑制时，eGFP-LC3 会弥散在细胞中，看不到斑点。因此通过计数荧光斑点估计自噬水平的高低。

注意：CQ 是下游自噬体抑制剂（见上图），加入时只会阻止自噬体进入溶酶体，因此 eGFP-LC3 会增多。如果加入上游抑制剂，绿色斑点将会减少则证明自噬抑制（因为自噬体生成变少，eGFP-LC3蛋白无法聚集）。

c| 候选分子自噬抑制效率

作者先加入下游抑制剂 CQ 四小时后，分别加入上游抑制剂 PIK-III（抑制VPS34蛋白）以及1-19候选小分子（ATG14L-Beclin1相互作用抑制剂），结果表明 加入19 号小分子，eGFP-LC3聚集斑点最少，抑制效率最高，IC50为33.9微摩尔，尽管活性低于PIK-III抑制剂。但是仍有优化的空间。目前该分子是唯一一个通过抑制蛋白蛋白相互作用而特异性抑制自噬的小分子。

▉ 亮点总结

1.证明了自噬途径中以 PPIs 为靶点的可行性。

2.成功筛选到了通过抑制蛋白-蛋白相互作用而选择性的抑制自噬的活性小分子的前体化合物。3.利用目前较为前沿的 NonoBRET 技术进行高通量筛选，效果显著。

原文引用：https://pubs.acs.org/doi/pdf/10.1021/jacs.9b12705

参考资料：

1.http://www.thealdrichlab.com

2.https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK464632/figure/ppi_cell.F3/

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作者Forever，北京大学医学部博士在读，微信(id:xs2014233)。目前已经有近400人药学交流群（好学，有趣且奔波于药学圈人才聚集于此）。进群加作者微信或者扫描二维码添加作者，此群仅为科研交流群，非诚勿扰。

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