Angew综述||看药物化学家如何重启“死亡猎手”---蛋白酶体（proteasome）

▉ 原文信息

今天给大家带来一篇有关靶向蛋白降解(targeted protein degradation, TPD)技术的综述文章，原文信息如上图。本综述全面概述了化学生物学和药物发现的各种TPD技术，并从药物化学家的角度分析了它们的优势和局限性。

▉ 前言

1975年，美国科学家Gideon Goldstein和同事从胸腺中分离得到一种由76个氨基酸组成的小肽。起初他们误以为这是一种胸腺激素，但随后发现这种蛋白质广泛存在于组织和真核生物中，“泛素”(ubiquitin, 来自拉丁文ubique: 处处，到处)由此得名。1977年，HarrisGoldknof和Ira Bush在细胞周期的研究中发现，在染色体的组蛋白H2A中与其异肽链共价结合的分子即是泛素。次年，受到Goldberg等人关于“ATP依赖性的蛋白分解系统”等相关论文的启发，Avram Hershko、Aron Ciechanover与Irwin Rose等从网织红细胞中分离得到活性组分APF-1 (active principle in fraction 1)，后来经证实APF-1与之前发现的泛素是同一种物质。

此后，经过多年的研究，人们逐渐了解了人体内经泛素介导的蛋白降解途径(图1-a)，即泛素通过E1(泛素活化酶)、E2(泛素结合酶)、E3(泛素连接酶)的多级反应与底物蛋白共价结合，随后含有泛素标记的蛋白被蛋白质水解酶体(Protease)识别并分解。2004年，由于Avram Hershko、Aron Ciechanover与Irwin Rose三位科学家在“泛素调节的蛋白质降解”领域的卓越贡献，被授予了诺贝尔化学奖。

在此基础上，发展出了靶向蛋白降解(targeted protein degradation, TPD)技术，并在过去的几十年中，在化学生物学和药学领域中得到广泛研究与应用。

▉细胞内蛋白的降解过程

图1. a) 泛素介导的蛋白降解途径；b) 细胞内天然蛋白质的降解方式；c) E3泛素连接酶复合体的结构。

细胞内天然蛋白质的降解主要通过以下两种方式：泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system, UPS)和自噬-溶酶体途径 (图1-b)。在E1、E2、E3酶的作用下，通过共价结合的方式蛋白质被打上泛素标记，随后被细胞内的溶酶体分解。泛素包含七个用于形成多聚泛素链的赖氨酸残基(Lys6、Lys11、Lys27、Lys29、Lys33、Lys48和Lys63)。其中Lys48和Lys11介导链接的泛素链主要被蛋白酶体降解，而Lys63介导链接的泛素链则更易于通过自噬途径降解。26S蛋白酶体能够有效降解短寿命、可溶性的未折叠或错误折叠的蛋白质和多肽，自噬-溶酶体途径则负责降解长寿命的蛋白质、不溶的蛋白质聚集体和功能异常的细胞器(变性的线粒体)。

泛素化是蛋白酶体降解和自噬降解的核心机制，而E3泛素连接酶是泛素化级联反应的核心部分。人体中有600多种基因可以编码E3泛素连接酶，且E3酶具有严格的空间与底物特异性，这有助于泛素化系统的特异性和复杂性。根据组成结构的不同，E3酶主要包括以下几类：RING (really interesting new gene)型、Cullin-RING型、U-Box型和HECT(homologous to the E6-AP carboxyl terminus)型，不同类型的E3酶发挥着不同的泛素连接机制。其中，数目最多的超家族是Cullin-RING型E3酶，它们由四个主要成分组成(图1-c)：发挥支架作用的Cullin蛋白、与E2酶结合的RING finger蛋白、识别靶标的受体蛋白和将受体与Cullin蛋白连接的衔接蛋白。迄今为止，仅有1%的E3连接酶被发现，且开发的主要是Cullin-RING型E3酶。在目前已被开发的Cullin-RING型E3酶中，按受体蛋白的不同主要可分为Cereblon (CRBN)、von Hoppel Lindau (VHL)、inhibitor ofapoptosis protein (IAP)和mouse double minute 2 (MDM2)四种。在人体中，这些受体蛋白与相应的内源性底物特异性结合并诱导它们的降解，平衡相关底物在胞内的含量。综上，通过人为地对目标蛋白(protein of interest, POI)进行修饰或设计双功能小分子，使受体蛋白与POI结合，随后利用泛素-蛋白质降解系统降解POI的过程就是TPD技术。

▉靶向蛋白降解技术(TPD)的分类

图2. 靶向蛋白降解技术的种类

如上所述，TPD技术主要分为两大类(图2)：通过基因编辑技术对POI进行定向修饰的降解标记蛋白(degradation of taggedtarget proteins)类，和设计双功能小分子的降解非标记蛋白(degradation ofuntagged target proteins)类。

由于需要基因编辑技术的参与，这使得降解标记蛋白技术目前只能作为工具用于生化或医学等领域的研究。与之相反，降解非标记蛋白技术仅通过双功能分子连接受体蛋白与POI形成复合物即可使POI泛素化并随之被降解，因此该类技术具有广大的药物开发的前景。本综述评估了不同蛋白降解技术的特点，并归纳得到如上表格。

如表所示，目前最具发展潜力的TPD技术为PROTACs(Proteolysis-targetingchimeras) 和分子胶水(Molecular Glue)。

▉PROTACs

PROTACs，即蛋白降解靶向嵌合体，是所有的TPD技术中是最具有成药可能性的。PROTACs一般由三部分组成：POI结合部分、Linker和E3酶受体蛋白结合部分(如上图)。目前，靶向不同POI的PROTACs已被广泛报道，如BRD4、BTK、BCR-ABL、PDEδ等。这些PROTACs主要使用度胺类小分子(CRBN targeting)和羟脯酸类拟肽(VHL targeting)作为受体蛋白结合部分。

图3. a) 100 nM的dBET1在18小时内能将MV4-11细胞中87％的BRD4降解掉，而差向异构体dBET1(R)则没有活性；b) ARV-825在结构上与dBET1类似，就诱导BRD4降解而言，其效力比dBET1高10倍^[1]。

基于PROTACs介导的蛋白质降解的巨大成功，由Arvinas®开发的两种PROTAC，ARV-110和ARV-471已于2019年进入临床试验，分别针对雄激素受体和雌激素受体。由Arvinas®发表的人体内PK数据的结果显示，它们的半衰期长达24小时甚至数天之久，预计将于2020年发布临床疗效数据。尽管PROTACs已表现出显著的有效性，但是仍有许多不足的地方需要解决。

1. PROTACs分子量一般在700~1200之间，这使得它们的透膜能力与(口服)生物利用度较差，且缺少如适用于小分子药物的“类药五原则”的预测模型，这使得目前大部分的研究仅仅证明了所设计的PROTAC在细胞水平上对靶蛋白降解的有效性与抗增殖活性。

2. 与传统小分子药物不同，目前尚无有效的高通量筛选技术用于快速、大量地评估PROTAC降解POI的能力，只能通过细胞活性筛选或免疫印迹实验等方法实现，这大大降低了开发PROTAC的速度与成功率。

3. 有文献报道，仅仅改变linker的长度或结构就会对PROTAC的降解能力有巨大影响(图 3)，这或许是由于在泛素化过程中不同的E3酶和POI之间所需的空间距离不同引起的。鉴于目前仍没有POI-Protac-E3酶复合物的晶体结构被解析得到，因此对linker部分的改造缺少指导方向。

4. 发现与E3酶受体蛋白特异性结合的底物具有偶然性，目前报道的PROTAC主要靶向CRBN与VHL，尽管CRBN与VHL是否会发生突变以及突变后是否对PROTAC有影响还是未知，但了解新的E3酶并开发相应的PROTAC具有重要意义，也面临巨大挑战

图4. PROTAC研发过程所需的测试与筛选流程

此外，本综述归纳并建议了PROTACs研发过程中需要进行的测试与筛选流程，如图4所示。

▉分子胶水

分子胶水的原理其实与PROTAC相同（如上图）。与PROTAC相比，分子胶水具有更小的分子量也更像目前常用的小分子药物，但是分子胶水的发现也更具有偶然性，目前仅有少量分子胶水介导的蛋白-蛋白相互作用被报道。

王少萌等[2]，在试图优化基于CRBN的MDM2双功能降解剂时，通过对分子结构进行微小的变化，得到了能够选择性降解翻译终止因子GSPT1的分子胶水。Nomura等[3]在对聚酮类天然产物manumycin的研究中发现，manumycin A与anumycin可以通过共价结合E3泛素连接酶UBR7与蛋白TP53，从而发挥抗增殖活性(引自公众号“王初课题组”2020年6月29日文)。Ebert等[4]通过筛选得到了CDK抑制剂(R)-CR8，结果表明CR8的嘧啶并咪唑母核能够与CDK12-cyclin K特异性结合，末端苯连吡啶则能很好地结合DDB1蛋白(衔接蛋白)，从而形成CUL4-RBX1-DDB1-CR8-CDK12-cyclinK复合物并诱导cyclin K的降解。该研究表明，修饰结合靶标的小分子的表面暴露区域是一种合理的策略，可用于开发特定蛋白质靶标的分子胶水降解剂(引自公众号“王初课题组”2020年6月14日文)。

总之，由于分子胶水的小分子性质和类药物特性，分子胶水在治疗领域的应用具有巨大潜力，但距离广泛开发仍有很多问题亟待解决。

▉  总结与展望

以传统的“占据学说”(occupation theory)为指导策略发现小分子药物已经获得巨大成功，但是由于人体内大部分蛋白缺乏结合口袋，使得许多蛋白成为了“undruggable target”。靶向蛋白质降解(TPD)技术通过劫持内源蛋白质降解机制来诱导致病蛋白质的耗竭或减少，提供了一种新颖的治疗方法。由于TPD仅需要以中等的结合能力募集POI，而非高亲和力的小分子，即可通过循环催化降解的方式分解目标蛋白，因此理论上也能够降解这些“undruggable target”(主要包括转录因子、仅发挥骨架功能的蛋白等)，具有巨大的药用潜力。除此以外，TPD还是有价值的化学生物学工具，可用于验证靶标并加深对蛋白质功能和细胞途径的了解。

“鉴于生物制剂的成功和基于核苷酸的疗法的新兴进展以及即将到来的基因疗法，小分子药物一直在寻找自己的解决方案，以解决“undruggable target”的问题。TPD技术有助于填补这一空白，它提供了一种基于药物化学方法的解决途径，该技术可与过去几十年中出现的许多新模式竞争。在该行业内，形成了类似淘金热的氛围，TPD是否能够实现其较高的期望尚待观察。但是，这绝对是在TPD技术的基础上开展工作并积极塑造下一代小分子药物的绝佳时机。”

参考资料:

[1] Toure M.,Crews C. M. Small-Molecule PROTACS: New Approaches to Protein Degradation [J]. Angew Chem Int Ed Engl, 2016, 55(6): 1966-73.

[2]    Yang J.,Li Y., Aguilar A., et al. SimpleStructural Modifications Converting a Bona fide MDM2 PROTAC Degrader into aMolecular Glue Molecule: A Cautionary Tale in the Design of PROTAC Degraders[J]. J Med Chem, 2019, 62(21): 9471-87.

[3]    Isobe Y.,Okumura M., McGregor L. M., et al.Manumycin polyketides act as molecular glues between UBR7 and P53 [J]. Nat Chem Biol, 2020,

[4]    SlabickiM., Kozicka Z., Petzold G., et al.The CDK inhibitor CR8 acts as a molecular glue degrader that depletes cyclin K[J]. Nature, 2020, 

编辑：Phm.

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