【药化经典】PI3K抑制剂：综述和新的开发策略

▉  导读

磷脂酰肌醇3-激酶( phosphoinositide 3-kinase，PI3Ks) 途径是人类癌症中最常被激活的信号通路之一，几乎介导50%的恶性肿瘤的发生。PI3K是一种胞内脂质磷酸激酶，催化肌醇第3位的磷酸化。PI3K是由一个催化亚基p110和一个调节亚基p85构成的异二聚体，具有SH2结构域 (Src Homology 2 domain)。通过SH2结构域，PI3K可与其它蛋白的磷酸化酪氨酸残基结合，从而被募集到质膜，使其催化亚基靠近质膜内小叶的磷脂酰肌醇。在膜脂代谢过程中，PI3K催化PI-4-P(PIP)生成PI-3,4-P2(PIP2)，催化PI-4,5-P2(PIP2)生成PI-3,4,5-P3(PIP3)。这些与膜结合的PI-3-P为多种信号转导蛋白提供了锚定位点，进而介导多种下游信号通路。例如活化Akt/PKB、mTOR激酶等下游通路。

根据PI3K的结构特点和底物分子可将其分为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型3 类。Ⅰ型分为IA型和IB型， IA型由受体酪氨酸激活，根据催化亚基p110的不同又可分为PI3Kα、PI3Kβ 和PI3Kδ 3个亚型；IB型即为PI3Kγ 亚型。IA型PI3K与肿瘤的发生发展密切相关，其中编译PI3Kα的基因PIK3CA是肿瘤中最常见的突变，PIK3CA突变后在异常激活PI3Kα的同时，还能抑制抑癌基因PTEN的表达，因此PI3Kα成为抗癌药物研发中极为重要的靶点

目前，已有许多PI3K抑制剂批准上市或进入临床研究。泛PI3K抑制剂，如buparlisib、pictilisb (GDC-0941)、copanlisib等，泛PI3K抑制剂可以作用于所有I型的PI3K亚型，因此副作用与毒性较大，使得它们的临床进展缓慢。选择性作用于某个PI3K亚型的抑制剂具有更小的毒副作用，已有部分选择性PI3K抑制剂获批上市。Alpelisib是FDA批准的第一个PI3Kα抑制剂用于乳腺癌治疗，当Alpelisib靶向PI3Kα时，观察到此药可以有效地降低特定突变组合的信号强度。虽然该药被归类为PI3Kα特异性药物，但通常会观察到严重的浓度依赖性副作用和耐药性。主要原因是该药物和以前开发的药物一样，都是ATP竞争性的，而PI3K各亚型之间的ATP结合位点几乎相同，当给药浓度增加，不可避免地对其它亚型产生抑制作用。因此降低副作用，对PI3K抑制剂的开发与癌症治疗具有重要意义。

本文作者Ruth Nussinov回顾了PI3K抑制剂，基于其课题组前期研究概述了PI3Kα激活的机制、致癌突变及其联合突变。最终提出了两种新的可能的PI3Kα抑制剂开发策略。(1) PI3Kα正构和别构抑制剂的联合使用；(2) 开发挽救突变位点的别构抑制剂。

▉ PI3Kα的激活机制

PI3K激活发生在质膜上，它是通过与RTK、RAS和膜上C-末端的磷酸化基序相互作用而介导的。如下图展示了突变位点导致PI3K激活的过程。

上图A：热点突变E542K和E545K模拟RTK在PI3Kα的解除自抑制中的作用机制，这一作用暴露了PI3Kα活性位点。H1047R模拟了RAS在PI3Kα激活过程的作用机制。这两处热点突变常伴随E453Q/K、E726K和M1043V/I等弱突变共同激活PI3Kα。大多数弱突变都远离p85α亚基的自抑制结构域nSH2和催化位点，推断它们可能在激活PI3Kα时起别构位点作用。

图B：热点突变（深色部分）主要发生在螺旋域和激酶结构域，弱突变发生在ABD和C2结构域的表面。ABD和C2中的iSH2结构域在激活的PI3Kα结构中活跃表达。

图C：含有自抑制区域的nSH2的PI3Kα的结构处于非活性构象

图D：PI3Kα在移除nSH2后并伴有a-loop时处于激活状态。

图E：移除nSH2结构域的PI3Kβ只具有部分活性。说明PI3Kβ被nSH2和cSH2同时抑制。这意味着PI3Kα和PI3Kβ亚型自抑制区域不同。

受到KRas4B共价抑制剂开发过程的启发，可以尝试发现新的PI3Kα的别构口袋，来开发PI3Kα的别构抑制剂，在维持抑制活性的同时提高化合物对PI3K亚型的选择性。

▉ PI3Kα与Alpelisib的相互作用解析

PI3K的ATP结合位点位于激酶结构域的两个片段之间，由铰链隔开。I型PI3K的ATP结合位点高度同源，仅在边缘处有几个残基不同。这些残基可分为分为两个区域，第一个是位于铰链附近的四个残基组成的可变区，第二个是位于P-loop处的较小的可变区。对于PI3Kα，铰链区可以提高ATP抑制剂的选择性。如图，Alpelisib结合激酶结构域中的ATP口袋，并与P-loop和铰链区相互作用。其中与Alpelisib接触的残基大多是保守的，只有铰链区五个可变残基（852RNSH855和Q859）。在这里，作者重点研究两个残基R852和Q859，因为其他三个残基（NSH）的侧链暴露于溶剂中，几乎不与Alpelisib的相互作用。PI3Kα的Q859与Alpelisib形成双氢键（图C），这表明并证实了其在亚型选择性中的重要性。此残基在PI3Kβ（D856）和PI3Kδ（N836）中变得更短，而PI3Kγ中的K890仍然足够长，足以与Alpelisib进行氢键相互作用。PI3Kα中的R852与激酶结构域N-lobe中的E798形成盐桥，在PI3Kγ（K831-E814）中观察到类似的盐桥。PI3Kγ的L829还与M762和W760建立疏水相互作用。而PI3Kβ中S849由于较短，则完全没有类似的相互作用。

这些结果表明，铰链区的结构与Alpelisib对PI3K的选择性有关。PI3Kα（~5 nM）的IC₅₀值最高，其次是PI3Kγ（~250 nM），PI3Kδ（~290 nM）和PI3Kβ（~1200 nM）。虽然，利用铰链区残基的差异设计高选择性的PI3K抑制剂取得一定进展，但是仍存在一些缺点。例如，人体中部分PIP2脂质以高亲和力锚定在细胞膜中，因此底物结合位点较浅，深埋于细胞膜的蛋白质表面进一步限制了小分子的进入。 

这使得模拟ATP结构，作用于铰链区的小分子抑制剂往往需要较高的给药浓度，随之而来的是脱靶效应带来的毒副作用。因此，寻找其它空腔并开发相应的抑制剂具有重要意义。

目前，一个非ATP类型的别构口袋已经被发现（PDB：4A55），然而该口袋尚不清楚其具体功能，作者认为该结合位点不太可能产生有效的别构抑制剂。基于片段的筛选，作者鉴定在E542K和E545K突变热点处具有磷酸肽结合作用的别构抑制剂口袋，并获得了满意的结果。这些变构口袋总结在上面图A和B中。此外，如上图C部分，在ABD和激酶结构域的N-lobe之间有一个口袋，该口袋较深，疏水性强，涉及的残基包括ABD–RBD接头中的115–123号残基，以及激酶域的N-lobe中的699–715号残基和840–845号残基。靶向此口袋的抑制剂有望增强ABD和iSH2的的结合界面，从而稳定了PI3Kα的失活构象。

▉ 开发PI3Kα抑制剂的新策略

a| 别构抑制剂联合正构抑制剂

曾经，人们发现：转移性间变性淋巴瘤激酶（ALK）的Cys至Tyr突变（C1156Y）使它对ATP竞争的药物克唑替尼耐药。之后的Lorlatinib也由于L1198F的突变，导致了耐药性。然而，明显的L1198F变构突变却使ALK对克唑替尼重新敏感，携带这种突变的患者再次接受克唑替尼治疗，癌症相关的症状得到缓解。这里，L1198F就是挽救性突变，该突变重新分布了ALK构象集合，促进克唑替尼的结合状态。因此，一旦发生挽救性突变，就不需要相应的别构抑制剂。如果在该位置没有这种突变，则可以模拟开发相应的别构抑制剂，从而促进ATP结合位点上的可容纳药物的构象变化。因此，别构药物可以像别构突变一样重新激活活性位点，从而恢复正构药物的作用。

别构药物与正构药物联合使用的概念并不新鲜，但在PI3Kα中尚未经过测试。别构药物通过改变构象封堵ATP竞争抑制剂，使正构抑制剂结合的更加稳定。或通过产生可成药的PIP2结合位点来克服PI3Kα耐药性。

b| 挽救性突变位点抑制剂的开发

如何确定此类突变的位置？早些时候作者研究von Hippel–Lindau肿瘤抑制蛋白（pVHL）的过程中，他们使用了分子动力学模拟，寻找蛋白质未结合状态中最不稳定的区域来确定可能的候选残基，这些残基减弱了两个结构域之间的连接，同时，在域间界面和域中设计了几个稳定性的突变。结果表明，在缺氧诱导因子（HIF）结合位点的疾病突变体Y98N破坏了pVHL的稳定性，并降低了其对HIF的亲和力，模拟表明pVHL的稳定性和结合力是别构调节的。因此，可以寻找稳定pVHL而远离结合位点的别构突变口袋。基于蠕虫的pVHL，作者通过设计取代片段来稳定Y98N突变体，降低了pVHL与HIF的复合物的结合能，以此稳定了pVHL，从而拯救了pVHL–HIF的亲和力和功能。

同样的，在PI3Kα中，挽救突变可以通过别构位点控制改变构象，从而在不增加其浓度的情况下提高ATP竞争药物对其结合位点的亲和力。激酶结构域的P-loop的突变位点可能是有希望的靶点。对于PTEN肿瘤抑制剂，也可以考虑采用这种策略。

此外设计别构抑制剂的关键还包括识别变构位点，包括隐性别构口袋。别构抑制剂可以形象的描述为“锚”和“驱动”的双重作用。锚固定在一个别构口袋中，使PI3Kα在非性状态和活性状态之间的转换过程中构象保持不变，驱动程序则“拉动”或“推动”蛋白质原子（侧链或主链）并使受体进入药物结合状态。

▉ 总结

PI3K是癌症药物开发的热门靶点，发展至今已有许多PI3K抑制剂上市或进入临床研究阶段。泛PI3K抑制剂由于对亚型选择性较差，往往具有较大的毒副作用；选择性PI3K抑制剂虽然在体外活性测试中有较好的亚型特异性，但是在体内仍然无法实现有效的选择性，使临床收益降低。本文主要介绍了与癌症密切相关的PI3Kα，分析了其结构特征与自抑制构象，简要介绍可能实现选择性抑制作用的别构口袋，为PI3K抑制剂的研究提供了新的思路。

参考资料：

1.PI3K inhibitors: review and new strategies

2.https://www.medicilon.com.cn/hang-ye-zi-xun/pdkzlywpi3kyzjdzxyjjz.shtml

编辑：LiAgBr🍐🍐。本文作者Stupid刚刚步入新婚殿堂，在这里祝福他新婚快乐。

药学速览公众号目前已经有近3个药学交流群（好学，有趣且奔波于药学圈人才聚集于此）。进群加微信（xs2014233）或者扫描二维码添加作者，此群仅为科研交流群，非诚勿扰。                           

如因版权等有疑问，请于本文刊发30日内联系药学速览。

原创内容未经授权，禁止转载至其他平台。

有问题可发邮件至[e-mail]获取更多信息。

©2020 药学速览 保留所有权利