凌波微课|扩增子研究第五讲：微生物群落研究建库测序流程

Original Young 凌波微课 2023-08-18

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微生物群落研究建库测序流程

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我是主讲人小Young，今天我们给大家分享的内容来自公众号“红皇后学术”，主题是：微生物群落研究建库测序流程。前几节课介绍的都是关于16S rRNA基因扩增子分析细菌群落的相关背景，从本节课开始，会逐步的介绍涉及的数据测试和分析过程。

本期凌波微课主要包括3个方面的内容：

对于16S rRNA扩增子研究微生物群落的技术，在获得测序原始数据之前的过程主要可以分为以下几个步骤，分别是样品的准备、DNA提取、目的片段PCR扩增、PCR产物纯化、文库制备和库检、以及最后的上机测序。

对于绝大多数老师和同学来说，至少在建库测序阶段应该都是会交给公司来做，毕竟测序仪这东西不是每个实验室都有，而且如果自身测试的样本量不是非常大的话，自己进行建库测序的成本可能比送到公司去测还要高。所以这里我们只是简要的介绍一下从样本准备到数据下机的一个基本过程，重点将会放在大部分老师和同学需要自己操作的样品准备和DNA提取过程。

01PART实验设计&样本制备

合理的实验设计是研究的关键，不同的条件或处理中（例如，土壤、水体、组织等），设置不同的分组处理，通过多样性扩增子测序方法研究菌群的组成以及差异物种，结合环境因子进行关联分析，再采用多组学方法进行更深入功能层面的研究。

实验设计好了之后，我们就要开始进行样本准备。对于样本准备来说，最重要的问题应该就是操作一定要规范以避免样本受到污染。

微生物在环境中无处不在，因此在样品采集和运输的过程中非常容易污染其它环境的微生物，就会直接导致得到的测序结果准确性下降。并且污染这个问题我们在研究的过程中还很难发现，最好的情况是在数据分析的过程中可能会发现有个别样品出现离群，但是到底是不是由于污染造成的也很难判断。而很多情况下，我们甚至无法判断样品是不是被污染了，这也是很多研究项目的数据最后得到的结果可能并不符合预期的一个重要的原因。甚至有些研究的结果会十分混乱，根本看不出什么明显的规律。

不过就算我们拿到结果之后怀疑样本有污染，我们也很难证明到底是不是被污染了。而且由于微生物群落研究的特殊性，几乎都是现场采集的环境样本，或者就是一些动物来源的共生微生物样本，几乎是没办法补的，而且就算还能采集到相同地点或者相同个体的样本，你真的觉得用今年的样本能代替去年的样本么？

可以说样本的收集是微生物群落研究中最为重要的步骤，在开始实验之前，样本的采集方案一定要构思的很清楚，宁肯费点劲多收集一些样本，哪怕最后没用也比写文章的时候发现需要补充样品又实现不了要强得多吧。

这里给大家介绍几种常见样本的取样方法，其他样本或者特殊样本取样方法可以在我们公众号后台留言或者在交流群中讨论。

农田/森林/草原土壤样本取样方法

第一步，按实验设计确定采样范围，取样器具需事先消毒灭菌处理。取样样方可参考这里，采用五点取样、多点取样、S形取样或者纵向深度取样；其次，采样时应去除地表杂质，根据需要挖取相应深度（如5~20 cm）的土壤，置于冰上运至实验室。去除可见杂质，建议过2 mm无菌筛网。

同一样方多点样本等量混合均匀后取5~10 g，保存无菌EP管中，进行核酸提取，或-80℃保存备用。若不能自行提取，可置于干冰寄送至公司。注：建议戴一次性手套、口罩，进行严格取样和操作，尽可能减少人为的污染。

水体取样方法

根据研究目的进行确定水体的取样深度和范围。

采样后进行滤膜过滤，选择合适孔径的滤膜，对于澄清水体或者略浑浊水体，选用0.22μm或者0.45μm的滤膜，取样体积大于5L；
对于浑浊水体，建议先用大孔径的滤膜过滤一遍，再用小孔径的滤膜过滤；
水体中另外一类常见的样本是淤泥，水体泥样的采集提供大于5g样本；
用大体积干冰运输，且要保证我方在收到样品开箱检验时有足够的干冰剩余。

注意：扩增子项目将3-5L水体过滤到1-2张滤膜（0.22或0.45um）后装入到离心管中；宏基因组项目将30-50L水体过滤到1-2张滤膜（0.22或0.45um）后装入到离心管中。

粪便样本取样方法

首先，要做好粪便取样前准备。（1）拍净尿液，以避免尿液对粪便样本的污染。（如在厕所取样，排空尿液后请冲厕，再行后续操作。（2）取样材料，样本储存器皿请提前进行灭菌处理，以确保无外源微生物污染。（3）生理期女性不能采样。（4）取样前3个月内没有使用过抗生素；若有，请注明使用时间及种类；因为抗生素对人体菌群影响较大。

粪便取样方法一：（1）冰袋要提前12小时放入冰箱；（2）将马桶座圈翻开，将粪便收集器支架放在马桶上，将收集器放在支架上；（3）放下马桶座圈，不要向收集器排尿，将粪便置于收集器中，样品收集后，从支架上取下收集器，盖紧盖子；（4）将收集器放入自封袋中，在盒子上记录收集样品的日期、时间，放入装有冰袋的泡沫盒中（冰袋放置方式见图，上下左右需都有冰袋），24 小时内送至实验室。

粪便取样方法二：（1）记录采样样品的相应信息（样本名，采样时间等）。（考虑哺乳动物肠道微生物的时间节律性变化）；无论是否何时采用，都需详细记录采样时间；（2）尽量避免尿液污染粪便，可以事先排尿，粪便尽可能排入洁净干燥容器内；（3）如厕完成后，用采样管（含保护液）中无菌勺挖取粪便中段没有接触空气和地面的部分，挖取一满勺（黄豆大小）；（4）将挖取的粪便连同小勺一同放入采样管中，盖紧盖子，液氮速冻(宏转录组样本准备必须步骤)；（5）将采样置于-80冰箱保藏，干冰寄送到实验室。

样本量问题：扩增子测序一般 3g 样本足够。宏基因组和宏转录组样本建议 5g 以上。请留好备份样本。

采样的过程中，所有的工具和容器一定要是无菌的！如果有条件最好现场分装好，存在液氮里，没有条件也要尽快冷藏运回实验室，以防降解。尤其是水体样本，最好是能在现场进行抽滤，然后直接保存和运输滤膜。

每个样品收集好后一定要分装，每一管够提一次DNA就可以了，样本多取一点，一部分用于提取测序所需的DNA，一部分用于其它实验指标的测定，但是每一个一定要保留一些样品，不然要是测序出了问题是真没法补了。另外还是要强调生物学重复的问题，建议在实验设计阶段就增加生物学重复样品的采集和测序，不然要是只有3个重复，其中一个结果不好那就没法调整了。

02PARTDNA抽提&扩增

首先，我们来看一下DNA提取的基本原理。DNA的提取可以简单的分为裂解和纯化两大步骤：裂解是破坏样品细胞结构，从而使样品中的DNA游离在裂解体系中的过程；纯化则是使DNA与裂解体系中的其它成分，如蛋白质、盐及其它杂质彻底分离的过程。

裂解过程

常规的裂解液都含有去污剂 (如SDS、Triton X-100、NP-40、Tween 20等) 和盐 (如Tris、EDTA、NaCl等)。去污剂的作用是使蛋白质变性；破坏膜结构；去除与核酸相互作用的蛋白质。盐的作用是提供合适的裂解环境，如Tris；抑制核酸酶对核酸的降解，如EDTA；维持核酸结构稳定，如NaCl。

纯化过程

纯化过程方法有多重：①酚氯仿抽提、高盐沉淀法、离心柱纯化、磁珠法。②离心柱纯化：是目前试剂盒提取广泛使用的方法。

DNA提取试剂盒推荐

DNA提取完成之后，接下来就是采用Qubit对DNA质量检测；

扩增子测序要求如下：

总量：≥ 500ng；
纯度：OD260/280在1.8-2.0之间；
浓度：≥5ng/μL。
DNA完整无降解，无RNA、蛋白质等污染。

宏基因组测序要求如下：

总量：≥2 μg；
纯度：OD260/280在1.8-2.0之间；
浓度：≥10 ng/μL。
DNA完整无降解，无RNA、蛋白质等污染。

提取成功的DNA样本就需要根据所选择的16S rRNA可变区进行PCR扩增，注意PCR所用的引物除了与16S rRNA特异性结合的序列之外，是需要额外链接barcode和接头。接头序列是根据测序仪器和试剂进行匹配的，而barcode是每一个样本特定的，不同样品的barcode序列不一样。这是由于16S rRNA扩增子测序数据量比较小，因而需要将不同样品的PCR产物混合在一起进行测序，以最大限度的节省成本，并且提高测序仪的使用效率。

既然是不同样品混合测序，在测序完成之后就需要对不同样品的序列进行区分，这一过程就是依赖于链接在引物末端的特定barcode序列。

PCR扩增采用TransStart Fastpfu DNA Polymerase，20μl反应体系：

PCR反应参数：a. 1× (5 minutes at 95°C); b. cycles× (30 seconds at 95°C, 30 seconds at Tm°C, 45 seconds at 72°C); c. 10 minutes at 72°C, 10°C until halted by user.