重磅！再次登顶 Nature，张锋团队研究新进展！

RNA引导系统是一种在原核生物和真核生物的生物过程中都起着核心作用的机制。其中，原核生物中的CRISPR-Cas系统通过RNA引导的核酸酶活性对外来遗传元件提供适应性免疫反应。例如，美国布罗德研究所以及麻省理工学院麦戈文大脑研究所的张峰团队前期发现的CRISPR相关蛋白酶，可以通过编程RNA激活的内肽酶活性对抗sigma因子抑制剂，以调节转录反应1。而在真核生物中，虽然目前已经研究了一些RNA引导系统，如RNA干扰和核糖体RNA修饰，但是否有RNA引导的内切酶仍不清楚。

在张峰团队最新的关于原核生物RNA引导系统(称为OMEGA)中，发现包含一个RNA引导的内切酶蛋白(即TnpB IscB,IsrB)和一个从转座子端区转录的非编码RNA（ncRNA）(称为ωRNA)2。OMEGA系统是CRISPR-Cas系统的祖先，效应物TnpB被认为是Cas12的始祖，具有RNA引导的内切酶活性。而TnpB与Fanzor(Fz)蛋白具有同源性，这提高了真核生物也具有CRISPR-Cas或OMEGA系统的可能性。

最近，张锋团队对这一可能性进行了验证，研究成果发表在Nature，题为“Fanzor is a eukaryotic programmable RNA-guided endonuclease”。该研究报道了一种由RNA引导的DNA内切酶Fz，可以被重新编程用于人类基因组工程应用3。证实了Fz是真核生物的OMEGA系统，表明RNA引导的内切酶存在于生命的所有领域。

https://doi.org/10.1038/s41586-023-06356-2

该研究首先评估了Fz的多样性，在数据库中搜索到来自TnpBs的两个不同分支的Fz1和Fz2，其可能是由两种不同的TnpBs转移到两个真核宿主而产生的，表明了Fz可能在真核物种之间转移。接下来比较了两种来源的TnpB，两种来源的Fz1和两种来源的Fz2结构。虽然它们在序列和大小上有很大的差异，但是它们具有相似的核心域架构，并且保守的核心区域和预测的活性催化位点表明，Fz可能能够执行RNA引导的命令。

Fanzor的系统发育分析

https://doi.org/10.1038/s41586-023-06356-2

进一步，为了测试Fz的RNA引导内切酶活性，通过系统基因组学确定了多个Fz位点，并且观察到与原生生物中相同的ncRNA种类，这表明Fz与转录的ncRNA结合，是一种ωRNA。证实了Fz与ncRNA之间的相互作用，并且在10种生物的20个Fz位点的ωRNA表达中得到了确认。

基于Fz与TnpB和Cas12的结构相似性，研究者假设Fz可以执行DNA切割，并且ωRNA将Fz引导到其靶点。通过采用先前开发OMEGA系统使用的靶邻近基序(TAM)鉴定试验，以及对产物进行测序验证。结果表明Fz1和Fz2都是ωRNA引导的内切酶。并且通过酿酒酵母重组表征，证实了TAM序列中的任何碱基突变都会完全消除切割，这也表明RNA引导的DNA内切酶活性强烈依赖于TAM。

接下来，研究者还测试了Fz-OMEGA系统是否可以用于人类细胞基因组中，实现RNA引导的DNA切割。结果显示Fz在人类细胞中也具有活性，且经过改造突变后，具有更高的基因编辑效率。这也证明了Fz在人类基因组工程应用中的巨大潜力。

最后，为了了解Fzl的DNA切割机制，通过低温电镜在2.7 Å的分辨率下确定了Fz与ωRNA等的结构。表明了Fz的双叶结构，Fz-TAM的识别机制，以及ωRNA在该蛋白的催化功能中的作用。在此之前，该团队也对原核生物中脱硫弧菌IsrB与ωRNA和靶DNA的复合体结构进行分析，突出了蛋白质和RNA之间功能的相互作用2。

SpuFanzor1结构

https://doi.org/10.1038/s41586-023-06356-2

除此之外，在近几年，张峰团队在遗传调控方面取得了许多重大研究成果。

首先，为了全面了解转录因子及其控制的程序，张峰团队创建了一个包含所有注释的人类转录因子剪接异构体的条形码库(>3500)，并开发了一个筛选平台，构建包含100万个细胞的转录因子图谱，绘制了每个转录因子的人类胚胎干细胞表达谱4。为系统阐明转录因子的基因程序、全面理解控制细胞状态的GRN提供了有价值的资源。另外，他们还报道了Bombyx mori R2 non-LTR逆转录转座子在其核糖体DNA靶点处启动TPRT的冷冻电子显微镜结构。表明目标DNA序列在插入位点被解开，并被上游基序识别。逆转录酶(RT)结构域的延伸识别逆转录转座子RNA，并引导3'端进入RT活性位点以模板逆转录5。该研究使用Cas9在体外将R2重定向到非原生序列，这表明未来可以作为一种基于可重编程RNA的基因插入工具。

总之，这些研究都促进了我们对这些不同系统的生物学和进化的理解，也对人类基因组工程提供了很多有利的技术支持和工具。

参考文献

1. RNA-activated protein cleavage with a CRISPR-associated endopeptidase

2. Structure of the OMEGA nickase IsrB in complex with ωRNA and target DNA

3. Fanzor is a eukaryotic programmable RNA-guided endonuclease

4. A transcription factor atlas of directed differentiation

5. Structure of the R2 non-LTR retrotransposon initiating target-primed reverse transcription

撰文 | 娜娜山

编辑 | 小白

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