开发国际首个光控RNA结合蛋白，华东理工大学团队实现RNA定时、定量、定点调控，希望尽快推进技术产业化|专访陈显军

RNA 在细胞内特定的时间和位置表现出复杂的动力学和功能。随着人类基因组测序项目启动及信息公布，科学家发现，人类基因组中非编码 RNA 占比高达 98%，且对比发现，生物进化得越高等，基因组中非编码 RNA 的比例越高。

非编码 RNA 不产生功能蛋白质产物，却是隐藏的幕后玩家。它可以与蛋白、DNA 和 RNA 相互作用，参与多种细胞活动，如基因的激活和沉默，RNA的剪接、修饰和编辑，蛋白质的翻译等，从而对生命进程起到或正向或反向的作用，包括影响细胞分化和癌症的发生发展。

因此，能够对 RNA 动力学和功能进行精确的时空操纵的技术，对于理解活细胞中 RNA 的生理功能是非常理想的，在医学领域也具有重要意义。但目前仍缺乏可以在活细胞内对 RNA 分子进行实时监测与精密控制的技术，这是深入研究 RNA 功能机制面临的关键问题和重要技术挑战，也是国际上 RNA 研究领域的前沿热点。

近日，华东理工大学杨弋教授团队在 Nature Biotechnology  在线发表了题为“Optogenetic control of RNA function and metabolism using engineered light-switchable RNA-binding proteins”的研究论文，该研究开发了一种光开关 RBP—— LicV，能够结合特定的 RNA 序列以响应蓝光照射，即实现了细胞内 RNA 功能和代谢的光调控。光遗传学与合成生物学交叉学科研究中心主任杨弋博士及其团队的陈显军博士作为论文的共同通讯。

此次，生辉 SynBio 邀请到文章的共同通讯作者陈显军博士与我们分享团队 RNA 研究的相关进展。

图丨陈显军博士（来源：受访者提供）

采访中，陈显军笑称自己是名副其实的华东理工大学“土著”，自 2005 年考入华东理工大学后，不断在校内扎根深造，2015 年博士毕业于化学生物技术与工程专业，2016~2018 年期间，在校从事博士后研究工作，出站后选择留校继续 RNA 方面的研究工作。

开发国际首个人工合成的光控 RNA 结合蛋白

在基因表达层面上，从 DNA 到 mRNA，再从 mRNA 到蛋白质，中间存在延迟。若从 RNA 转录后的代谢进行调控，相对于此前基因表达系统来说，则延迟更少，更加及时。在细胞中，RNA 的代谢调控很多都是由 RNA 结合蛋白（RBP）来执行的。RNA 结合蛋白是细胞中一类非常重要的蛋白质，它们通过识别 RNA 的特殊序列或结构与 RNA 结合，广泛参与到 RNA 剪切、转运、编辑、定位及翻译等多个转录后代谢调控过程，在调节细胞环境中 RNA 的功能方面发挥着重要作用。

这与陈显军所在团队的研究方向不谋而合——通过调控转录以及转录后代谢过程，进而控制基因的表达。“我们曾尝试寻找活性可控的细胞內源 RNA 结合蛋白，但并没有收获”，陈显军说道，“因此，团队瞄准了光遗传学技术。” 虽然光遗传学是一项新兴的技术，但陈显军所在团队已经取得相当扎实的科研成果。其中一项研究，开发了一个简单高效的 LightOn 光控基因表达系统，即 RNA 转录的光遗传学定时、定量和定位精密控制，相关成果于 2012 年发表在 Nature Methods 上。 

此前，团队基于光敏蛋白原创发展了一系列光敏元件，主要是光控 DNA 结合蛋白 (DBP)，这些光开关 DBP一般由两个模块组成，分别是 DNA 结合域和包含光-氧-电压 (LOV) 域的光敏结构域。

基于上述工作，研究人员此次以类似的思路构建了国际首个人工合成的光控 RNA 结合蛋白 LicV。LicV 是 LicT 的 CAT 结构域（LicTCAT）与 Vivid （VVD）的融合蛋白。

其中，LicT 是从枯草芽孢杆菌中鉴定获得的转录抗终止蛋白，由一个 N 端 RNA 结合结构域（CAT）和两个可磷酸化的磷酸转移酶系统调控结构域组成。LicT 发生二聚化的同时，能够特异性地结合核糖核酸抗终止子（RAT） RNA 序列，阻止 RNA 终止子茎环结构的形成。Vivid 蛋白（VVD）能够在蓝光下激活，迅速形成二聚体。

图丨通过光开关RBP调控转录的示意图。蓝光照射可诱导光开关RBP的二聚化，增强其与RAT蛋白的结合，防止RNA终止子茎环结构的形成，从而导致报告基因的转录。

基于以上特性，融合蛋白 LicTCAT-VVD 能够实现光调控。有光源时，受光诱导发生二聚化，从而增强其与 RNA 结合的能力；去掉光源后，则会出现蛋白二聚体的逐渐解聚，进而从 RNA 上解离。 

LicV 则是含有不同连接子的 LicTCAT-VVD 中，蓝光照射和黑暗状态下具有最大荧光强度变化的融合蛋白。

研究者们通过多场景验证，证明了当与各种 RNA 效应器融合时，LicV 允许对细胞培养中的 RNA 定位、剪接、翻译和稳定性进行光遗传学控制。此外，LicV 辅助的 CRISPR-Cas 系统允许对转录和基因组位点标记进行有效和可调的光开关调节。这些数据表明，可光控 RBP LicV 可作为可编程支架用于合成 RNA 效应器的时空控制。

希望尽快推进产业化

实际上，对于 RNA 结合蛋白调控的研究并不多，一些化学小分子（例如四环素）可能被用作传统开关调控RNA结合蛋白的活性，但缺点十分明显，一方面是本身具有副作用；另一方面，调节可逆性不强，即一旦加入，就会持续打开，只能等到生物体将其完全代谢掉，效果才会关闭，时间往往很长。相对来说，光调节既不会产生残留，也不需要机体代谢。

“而通过 LicV 实现的最重要的应用就是，利用光照能够实现对细胞内 RNA 代谢与功能的时空精密控制。”陈显军表示。 

相对应的，其在医学领域的潜在应用将包括，第一，通过对剂量的精确控制，避免治疗过当或者治疗不足，实现精准医疗，同时也可用于生物制造中代谢流的精准调控，提升生物制造效率；第二，或将应用于改善 CRISPR 技术的脱靶问题。

CRISPR 技术是目前人类生物学、农业和微生物学等领域最流行的基因编辑工具。自 2012 年以来，该技术用于对生物的 DNA 序列进行破坏、插入或替换。但是 CRISPR 系统本身存在容易脱靶，从而产生错误编辑的隐患。

根据陈显军介绍，团队分析了大量的报告和资料，认为 CRISPR 脱靶一方面是因为其本身的性质，另一方面则是由于活性不可控。具体来说，其在细胞内完成编辑任务之后，活性并未消失，这在提高了编辑效率的同时也增加了脱靶风险，而将基于 LicV 的 RNA 效应因子与 CRISPR 系统结合，可以在其发挥功能之后，关闭开关使活性丧失，从而降低脱靶效应。目前，基于上述设想的验证实验正在进行中。 

图丨利用LA-CRISPR系统进行基因组位点标记的光遗传控制（来源：论文）

同时，陈显军也向生辉 SynBio 介绍了团队接下来的研究内容。

研究中，光控 RBP 能够被蓝光激活，是取决于这个元件中光敏蛋白本身的性质。据陈显军介绍，选择蓝光是因为基于之前的研究，经验较足，团队已经充分考虑到活体应用中蓝光穿透力有限的问题，仅以蓝光作为示例，更长波长的一些 RNA 光遗传学工具，后面会陆续公布。

“接下来，还会在第一个光控 RBP 的基础上，陆续开发多个 RBP，但绝不仅仅是第一个的重复。我们需要的是一整套的光控 RBP，具体来说，目前我们可以用 LicV 控制细胞里面任意特定的 RNA，但是如果想要同时控制两个、三个甚至多个 RNA，就需要发展生物正交的 RNA 结合蛋白或者 RNA 的调控工具，即实现同时调控且互不影响。”

陈显军还透露，“对于光控 RNA 技术以及围绕降低 CRISPR 系统的脱靶性这两个板块，我们都希望尽快推进产业化，其潜在的应用场景包括‘合成生物学与生物制造’和‘精准医疗’。”该技术可通过精密调控 RNA 的代谢，来控制基因回路，加强人工代谢途径与宿主细胞适配性，提升生物制造效率。光遗传学工具在时间、剂量、速度与可逆性的精准控制上具有很强优势，可助力精准医疗。团队目前的研究项目除了 RNA 调控，还包括 RNA 成像和 RNA 标记，其产业化进度更快，将于合适的时机公布。

采访最后，陈显军还表示，合成生物学已经成为世界各国一个非常重点甚至战略性的部署，这也意味着需要更多的合成生物学工具，我们团队将借着这一股热风，在元器件的开发以及后续开展的合成生物学应用方面将大有作为。

参考资料：

• http://www.gibh.cas.cn/kxcb/kpwz/201107/t20110722_3312803.html
• https://www.nature.com/articles/s41587-021-01112-1
• https://doi.org/10.1038/nmeth.1892

点击关注生辉SynBio，专注于合成生物学科研及产业化的全链条内容和数据品牌↓↓↓
——  你可能错过的  ——