重磅推荐| 光遗传学史诗

前言

1953年2月28号中午

Eagle酒馆和往常一样

顾客们边用餐边低声交谈

一个瘦高的年轻人突然站起来

兴奋地向在场众人宣布

他和一位朋友

建立了DNA的双螺旋结构分子模型

话音未落

满座皆惊

分子生物学和分子遗传学的两扇大门

就此打开

如今的Eagle酒馆依旧在剑桥大学里营业

或许那个时候

踌躇满志的弗朗西斯·克里克不会想到

多年以后

他的研究兴趣竟转到了

意识的神经科学

而他和詹姆斯·沃森开创的分子遗传学

也成为神经科学领域

最高效有力的工具之一

当然

此时距离光遗传学的诞生

还有半个多世纪

刚刚萌芽的神经科学领域

还在为爆炸式的发展

积蓄着能量 

脑切除

电刺激

化学刺激

是那个时期的科学家

研究大脑功能的主要手段

卡农切除猫大脑皮层的经典实验

导致了猫的“假怒”

从而确定了下丘脑在情绪表达中的作用

切除大脑皮层后，猫的下丘脑受到的抑制解除，产生亢奋性“假怒”[3]

奥尔兹在大鼠下丘脑埋入电极

他惊喜地发现

大鼠会无休止地按压杠杆

来获得电极对下丘脑的不间断刺激

人们第一次意识到脑内存在奖励中枢

杠杆是控制电刺激器的开关

大胆的医生开始尝试使用电刺激疗法

去治疗棘手的发作性睡病和严重癫痫

虽然治疗以失败告终

却发现了隔区和中脑被盖区等脑区

能够让患者产生愉悦感

振奋人心的发现接踵而来

传统技术的几个局限性

也渐渐被放大

对动物造成的损伤太大

难以实现精确的时空操纵

要对不同类型的神经细胞进行区分研究

更是天方夜谭

整个神经科学界都在盼望着一种

激动人心的技术

1.死胡同

基于20世纪前半叶

临床实践不断发现新的脑的认知功能

基础研究也迅速积累大量理论基础

神经解剖学、神经生理学、神经药理学、神经化学、神经生物物理学、心理学、神经病学以及精神病学等学科

终于融合为统一的神经科学

1960年，国际脑研究组织（IBRO）成立

神经科学领域欣欣向荣

然而工具性的问题依然迟迟没有得到解决

早在三四十年代

Hodgkin和Huxley等人就在乌贼巨轴突上

记录到了单个神经元内的活动电位情况

Hodgkin（左）和Huxley（右）在乌贼巨轴突上开展的系列工作获得了诺贝尔奖[3]

这种电生理技术

宛如装在神经元上的电话窃听器

它可以精确测量

单个神经细胞上的电信号

不幸的是

任何一次简单的大脑活动

都可能有数亿个神经元参与

只测量其中一两个神经细胞的活动

就像妄图

只凭借几个字

去猜测一整本小说的剧情

60年代的耶鲁大学

迸发出第一束思维火花

劳伦斯·科恩教授

着手引入一种

光的元素

神经元电信号看不见、摸不着

但如果能让它们发出可见光

神经科学家就能照亮小说的剧情！

这种方法的关键是一种化学染料

其结构对电压变化敏感

神经细胞的电信号产生变化

染料分子就会发出荧光

于是

人类第一次亲眼看到了

能够编码意识的神经细胞的活动

接着，科恩他们又发展出了神经细胞的钙成像染料，反映神经钙活动变化

这次技术突破

解决了数量的局限

神经科学家再也不用摸瞎了

吸附上染料之后

一大群神经元的活动

都能看得一清二楚

然而不幸的是

这条路似乎走进了死胡同

化学染料本身就存在很多缺点

首先就是极低的选择性

同一时刻活动的神经元都会无差别发光

就像在上空俯瞰一个巨星的演唱会现场一样

放眼望去，人潮澎湃

但要知道某一个区域的人群特点

还是难于上青天

那时所有的科学家都没有意识到

这个问题的解决方案

早在1962年

就已藏在一篇论文的注脚里

之后的30多年里

科学家们都没能解决这个问题

2.绿光

--光与遗传第一次亲密接触

电压敏感成像染料刚发明的时候

科恩的研究团队可谓是大红大紫

美国东海岸的伍兹霍尔海边

一大批心怀梦想的科学家

白天躲在各自的实验室里辛苦研究

晚上则聚在海滩或酒吧里高谈阔论

与此同时

在美国西海岸

西雅图旁的星期五港湾里

一个默默无闻的日本籍博士后

头戴渔夫帽，手持大网兜

就像一个不知疲倦的小男孩

日复一日

年复一年

在海边打捞一种神奇的水母

星期五港湾的夏季暖流里

成群的多管水母

在夜色里发着荧荧绿光

下村修想知道这些水母发绿光的诀窍

有了足够的水母

他成功提取出了水母素

一种在发出幽幽蓝光的蛋白质

同时还发现了一种极微量的发绿光的蛋白质

虽然只被写进论文的注脚

但它—绿色荧光蛋白

(green fluorescent protein，GFP)

终于还是向人类露出了庐山真面目

可惜那时没有人想到这种绿色蛋白的作用

经过近30年的沉寂

随着基因技术的发展

GFP蛋白相继经历了

基因序列确定（1992）

异源生物体表达（1994）

结构突变改良（1994）

三大重要阶段

完成了光与遗传的第一次亲密接触

从此GFP一跃跨上历史舞台

成为蛋白质或细胞示踪研究中最有力的武器

把GFP基因编码在目标基因旁边，可以和该基因一起表达，

从而很方便地标记各种生物细胞和蛋白[18]

因对GFP的发展做出重要贡献而获2008年诺贝尔化学奖[11]

下村修（左）、查尔菲（中）、钱永健（右）

GFP基于其特殊结构而发光

细微的结构变化

光度就会大大下降

根据这个特点

如果有另一种蛋白

能感应环境的变化而改变结构

那么

把GFP加到这种蛋白上

我们就会看到神奇的连锁反应：

环境变化→感应蛋白结构变化→GFP跟着变化结构→荧光强度改变

现在要做的

就是简单的加法

GFP+电压敏感蛋白=神经膜电位变化指示荧光蛋白

GFP+钙敏感蛋白=神经钙信号敏感荧光蛋白

GFP+多巴胺受体蛋白=多巴胺信号荧光探针

GFP+蛋白激酶A(PKA)=细胞内信号通路荧光探针

…

图a、b、c：电压敏感膜的电位变化指示蛋白[9]

图d、e、f：钙离子浓度敏感的钙指示荧光蛋白

斑马鱼大脑神经元活动钙信号记录

最重要的一点

如果把GFP的基因

编码到特定基因附近

GFP就会特定地表达在指定类型的细胞里

即可实现对指定类型细胞的精确研究

亿万年以来

星期五港湾的水母发着荧荧绿光

从下村修当年充满好奇的注视开始

科学界当年的梦想

终于开始一点点实现！

3.大爆炸

光

解决了大脑的观测难题

少数敏锐的科学家

马上意识到

没准可以用光

解决操纵难题

用光

优势很显然

低损伤

精确的时空操纵 

假如再像GFP一样

结合基因技术

更是巧上加巧

可以一举解决

操纵特定细胞类型的难题

在光和神经元之间

现在只缺少一个媒介了

由于神经元对光照没有反应

理想的媒介

即需要能感受到光照

又必须是一个开关

在接受光照后能兴奋或沉默神经元

眼睛里的视紫红质

似乎符合要求

可惜视网膜光转导需要十几个蛋白一起工作

把他们一起表达到细胞上面

工程量艰巨浩大

在一些实验室专注视紫红质之时

斯坦福的Karl和Boyden

另辟蹊径

2003年发现的衣藻中的单个光敏蛋白

完美集合了感光和开关功能

只需要两步

1.把光敏蛋白的基因表达在神经元上

2.给予激发光

Karl和Boyden也没想到

成功来得这么突然

脆弱的神经元竟然被光激活了！

 简单就是美有着深刻的科学基础

a.眼睛需要繁多的蛋白（仅示意一部分）参与光转导为电信号

b.发现于莱茵衣藻中的单个光敏感通道却很简单[13]

自此

光遗传学横空出世

工具性问题终被解决

这一束光

不仅激活了小小的神经元

还引发了整个学界的大爆炸

2010年

光遗传技术被评为

“年度方法”

“近十年重大突破”

Karl Deisseroth（左）和Edward Boyden（右）因光遗传技术获2016年科学突破奖

利用光遗传

研究者轻易地让实验动物

跑得更快

睡得更香

心情更好

不自闭

也不抑郁了

甚至多年不治的阳痿问题

都解决了

蓝光激活光敏感蛋白，导致大鼠勃起乃至射精 Angew. Chem. Int. Ed. 2015

基于光遗传技术的研究

从此一发不可收拾

运动、感觉、情绪、睡眠、性

学习、记忆、语言、认知

以及成瘾、抑郁、自闭、精神分裂等

神经科学攒了数十年的问题

都得到了大跃进式的进展

神经科学一举进入鼎盛时期

过去数十年光遗传相关工作发表量，Karl工作发表之后得到爆炸式增长[18]

2009年

光遗传学进入国内

从此

国内神经科学研究蓬勃发展

遍地开花 

4.挑战

当然

光遗传

也不可避免的存在技术瑕疵

人为用光照激活神经元

固然方便快捷

很多研究的刺激强度

却可能在无意间

超出了神经元应答生理范围

从而得到偏颇的结论

而难以均质地表达光敏感蛋白

以及均质地给予光照

也是该技术令人诟病的地方

对转基因动物的依赖

更使得其只能在现有的品系范围内施展拳脚

对很多特定神经元亚群的研究

只能望而却步

即使如此

作为当今最重要的生物技术之一

光遗传

依旧以其划时代的强大特性

和极其灵活的应用性

屡屡登上各大顶级刊物

光遗传病毒的灵活表达策略组合[21]

每一次技术革命

都会催生出认知上

质的飞跃

有了神经元层面上

操纵大脑的工具

我们似乎

向意识的神秘领域跨出了一大步

走出实验室的光遗传技术

也开始在人类疑难杂症上大展身手

失明、成瘾、慢性痛、帕金森等疾病

相关的临床研究都已经轰轰烈烈地展开

也许不久的将来

医生只要一束光

就能缓解病人的痛苦

Amazing and magical

不是平地一声雷

而是凝结着半个世纪的智慧

这就是

光遗传学

参考文献：

1. Shimomura O. Discovery of green fluorescent protein. Methods Biochem Anal. 2006

2. Shimomura O., Johnson F. H., Saiga Y. (1962). Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. J. Cell. Comp.Physiol. 59:223–239.

3. In search of memory. Eric R. Kandel.2007

4. St-Pierre F, Marshall JD, Yang Y, et al. High-fidelity optical reporting of neuronal electrical activity with an ultrafast fluorescent voltage sensor. Nat Neurosci, 2014, 17(6): 884-9

5. Akemann W, Song C, Mutoh H, et al. Route to genetically targeted optical electrophysiology: development and applications of voltage-sensitive fluorescent proteins. Neurophotonics, 2015, 2(2)

6. Berlin S, Carroll EC, Newman ZL, et al. Photoactivatable genetically encoded calcium indicators for targeted neuronal imaging. Nat Methods, 2015, 12(9): 852-8

7. Nagel G, Ollig D, Fuhrmann M, et al. Channelrhodopsin-1: a light-gated proton channel in green algae. Science, 2002, 296(5577): 2395-8

8. Nagel G, Szellas T, Huhn W, et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U S A, 2003, 100(24): 13940-5

9. Akemann W, Song C, Mutoh H, et al. Route to genetically targeted optical electrophysiology: development and applications of voltage-sensitive fluorescent proteins. Neurophotonics, 2015, 2(2)

10. 做贡献的人很多，登上领奖台的只有三个.科学春秋.2016

11. "The Nobel Prize in Chemistry 2008". The Official Web Site of the Nobel Foundation. Retrieved 2008-11-04.

12. Prasher DC, Eckenrode VK, Ward WW, Prendergast FG, Cormier MJ. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. Gene. 1992;111(2):229-33（GFP基因序列）

13. 光遗传学：一项注定要得诺贝尔奖的技术.知识分子.2016

14. Chalfie M, Tu Y, Euskirchen G, Ward WW, Prasher DC. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 1994;263(5148):802-5（异源生物体表达）、

15. Heim R, Prasher DC, Tsien RY. Wavelength mutations and posttranslational autoxidation of green fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 1994;91(26):12501-4（结构突变改良）

16. Crick, Francis. "The impact of molecular biology on neuroscience." Philosophical Transactions of the Royal Society of London B: Biological Sciences 354.1392 (1999): 2021-2025（第一次提出用光操纵神经的想法）

17. Boyden ES, Zhang F, Bamberg E, et al. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci, 2005, 8(9): 1263-8（光遗传）

18. Deisseroth K. Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nat Neurosci. 2015;18(9):1213-25

19. https://biochemaliensunite.wordpress.com/2013/03

20. A Synthetic Erectile Optogenetic Stimulator Enabling Blue-Light-Inducible Penile Erection[J]. Angewandte Chemie, 2015, 127(20):6031-6036.

21. OferYizhar,et.al.Optogenetics in Neural Systems. Neuron.2011

作者信息

 

作者：C57（浙江大学神经生物学博士）

校审/排版：Simon （brainnews编辑部）

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