“探针王子”李毓龙又发布新探针啦
去年，brainnews为大家盘点过“探针王子”李毓龙近2年的成绩——“探针王子”李毓龙的这两年：成绩斐然！
半年过去了，“探针王子”李毓龙实验室继续发力，发布多个新探针！下面让我们来一起学习一下。
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红色GRAB DA探针和第二代绿色GRAB DA探针
2018年，李毓龙实验室开发出第一代基于G蛋白偶联受体的绿色荧光多巴胺探针（GPCR-Activation-Based sensor for DA，简称GRABDA），该探针克服了已有多巴胺检测手段中时空分辨率低、分子特异性低的问题，被广泛地应用于活体果蝇、小鼠、斑马鱼、斑马雀等模式生物的多巴胺功能研究。
图1. 新型红色多巴胺探针和第二代绿色多巴胺探针的荧光响应情况
本次，他们在发表的第一代探针的基础上继续进行改造与优化，成功开发出新型的具有红色荧光的多巴胺探针（rGRABDA1m和rGRABDA1h）和具有更高灵敏度及成像信噪比的第二代绿色荧光多巴胺探针（GRABDA2m和GRABDA2h）。新型红色探针可以与已有的绿色荧光探针（如钙离子探针，其他神经递质探针）共同使用实现双色成像，第二代绿色荧光探针较第一代探针在反应幅度上提升约3倍（图1）。
探针详情：新探针 | 红色GRAB DA探针和第二代绿色GRAB DA探针
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五羟色胺探针可实现活体动物五羟色胺信号的实时灵敏检测
基于GRAB探针的开发原理，通过利用自然进化的五羟色胺G蛋白偶联受体在感受配体后会发生构象改变的特性，将其与循环重排的荧光蛋白偶联，把构象变化转换为可以检测的光学信号，开发出了可遗传编码并能够特异性检测五羟色胺的荧光探针，命名为GPCR-Activation-Based sensor for 5-HT，简称GRAB5-HT 。通过蛋白质工程的手段，对GRAB5-HT 探针进行了一系列的优化筛选，并最终得到了具有高特异性，高亲和力，亚秒级别反应动力学，以及高时空分辨率的五羟色胺探针。
图2 五羟色胺探针GRAB5-HT1.0 在体外培养的细胞中的特性刻画
GRAB5-HT1.0 探针在体外培养的神经元上对外源加入的饱和浓度的5-HT 可以达到~300%的响应，对应的作为对照组的GRAB5-HTmut （对5-HT不响应）则没有明显的荧光强度变化（图2b）。同时，该探针对5-HT具有较快的响应速度，可以达到亚秒级别（图2c）。除此之外，该探针还具有较好的特异性，只对5-HT有响应，对其它神经递质/调质则不响应（图2d）。
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新一代乙酰胆碱探针可实现活体胆碱能信号的灵敏检测
基于GRAB探针策略，即将神经递质特异的G蛋白偶联受体结合配体后的激活转变为荧光信号变化的策略，实验室之前的工作成功构建了第一个能够活体检测乙酰胆碱动态变化的荧光探针，GRABACh2.0（ACh2.0）,其可实现对体外和体内乙酰胆碱的快速及特异的荧光检测（Jing M, et al., Nature Biotechnology, 2018）。本工作旨在进一步提高乙酰胆碱探针的检测灵敏度，在已有探针的基础上进行了系统性突变筛选，最终获得了新版本探针，命名为GRABACh3.0 （ACh3.0）。
图3：新一代乙酰胆碱探针ACh3.0具有明显提高的检测灵敏度
我们在培养神经元、急性小鼠脑片和活体转基因果蝇等一系列系统中对ACh3.0和ACh2.0进行了系统的比较。ACh3.0在结合乙酰胆碱后表现出接近300%的最大荧光变化量，比ACh2.0探针的反应增大了三倍以上（图3，a）。同时，应用ACh3.0探针可观测到果蝇嗅觉中枢蘑菇体在接受特定刺激后表现出空间特异的乙酰胆碱信号，暗示乙酰胆碱信号可能通过不同的时空特征来进行信息编码（图3，b）。
探针详情：新探针 | 新一代乙酰胆碱探针可实现活体胆碱能信号的灵敏检测
更多关于新探针的消息，请关注微信公众号：李毓龙实验室（ID：yulonglilab）
本文中探针的获取方式详见实验室网站：http://www.yulonglilab.org/resources_cn.html
李毓龙：北京大学生命科学学院、北大-清华生命科学联合中心，麦戈文脑研究所研究员
官网的介绍：
研究兴趣：人的大脑有超过几十亿个神经元。这些神经元分为上千个种类，并通过上千亿个突触相互联系。我们发展高效的可遗传编码的荧光分子探针，研究新的成像的方法，并结合两者研究神经元细胞水平上的信号转导，分析神经环路中细胞可兴奋性及突触传递调控的机制。我们还用发展的可视化方法探索在疾病模型中的神经系统环路上的可能的病变及机能障碍。高灵敏的光学成像技术可以提供重要的时空分辨率，多路观测可以同时对多个神经元成像，这些新的方法对于揭开大脑神经调质的特异性的细胞基础提供了有效的方法。我们希望我们新的技术发展能让更多的神经生物学家能用简单有效的方法分析神经局部环路中复杂的突触的活动，解析大脑精巧的结构与功能的关系。
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