精选30余款宏基因组分析软件，来自老司机的使用经验总结（下篇）

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微生物组学研究中，宏基因组是最为核心的一环。结合自己的实战经验和其他文献中的报道，我为大家整理了一些主流宏基因组分析软件并稍作评述。

今天是最后一篇，希望通过这三篇内容，大家能了解和掌握更多宏基因组分析的工具，并清楚各个工具的优缺点。

上篇主要介绍了流程集成、数据质控、去宿主、组装相关的11款软件及使用心得（这才是重点！！）

中篇主要介绍了基因预测和物种注释相关的10款软件。

本篇，我们将盘点20款功能注释的数据库和binning软件，如下：

06

功能注释

1、KEGG

A database resource for understanding high-level functions and utilities of the biological system, such as the cell, the organism and the ecosystem, from molecular-level information, especially large-scale molecular datasets generated by genome sequencing and other high-throughput experimental technologies.

最新版本：

Release 84.0（最近一次更新在2017年10月）

参考文献：PMID: 10592173

下载地址：

http://www.kegg.jp/kegg/download/

官网地址：

http://www.genome.jp/kegg/

2、CAZy

The CAZy database describes the families of structurally-related catalytic and carbohydrate-binding modules (or functional domains) of enzymes that degrade, modify, or create glycosidic bonds.

参考文献：PMID: 24270786

官网地址：http://www.cazy.org/

3、COG

Phylogenetic classification of proteins encoded in complete genomes.

参考文献：PMID: 25428365

下载地址：ftp://ftp.ncbi.nih.gov/pub/COG/

官网地址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/

4、EggNOG

A database of orthologous groups and functional annotation.

最新版本：

Version 4.5.1（最近一次更新在2016年11月）

参考文献：PMID: 26582926

下载地址：

http://eggnogdb.embl.de/download/

官网地址：

http://eggnogdb.embl.de/#/app/home

5、ARDB

Antibiotic Resistance Genes Database.

最新版本：

Version 1.1（最近一次更新在2009年7月）

参考文献：PMID:18832362

下载地址：

ftp://ftp.cbcb.umd.edu/pub/data/ARDB/ARDBflatFiles.tar.gz

官网地址：

https://ardb.cbcb.umd.edu/

6、CARD

A bioinformatic database of resistance genes, their products and associated phenotypes.

最新版本：

Version 1.2.0（最近一次更新在2017年9月）

参考文献：PMID:27789705

下载地址：https://card.mcmaster.ca/download

官网地址：https://card.mcmaster.ca/

7、Pfam

The Pfam database is a large collection of protein families, each represented by multiple sequence alignments and hidden Markov models (HMMs).

最新版本：

Pfam 31.0 (最近一次更新在2017年3月)

参考文献：PMID:26673716

下载地址：

ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/Pfam/releases/Pfam31.0/

官网地址：http://pfam.xfam.org/

8、Resfams

Resfams is a curated database of protein families and associated profile hidden Markov models (HMMs), confirmed for antibiotic resistance function and organized by ontology.

最新版本：

Version 1.2.1（最近一次更新在2017年3月）

参考文献：PMID: 25003965

官网地址：

http://www.dantaslab.org/resfams/

9、NR

The nr protein database maintained by NCBI as a target for their BLAST search services is a composite of SwissProt, SwissProt updates, PIR, PDB. Entries with absolutely identical sequences have been merged.

最新版本：

最新一次更新在2017年3月

参考文献：

doi：10.3969/j.issn.1000-3428.2006.05.026

下载地址：

ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db

10、Swiss-Prot

SwissProt is a highly-curated, highly-crossreferenced, non-redundant database.

参考文献：PMID:27899622

下载地址：

ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/sp_tr_nrdb/)

官网地址：

http://www.gpmaw.com/html/swiss-prot.html

11、VFDB

The virulence factor database (VFDB) is an integrated and comprehensive online resource for curating information about virulence factors of bacterial pathogens.

最新版本：

最近一次更新在2017年10月

参考文献：PMID:26578559

下载地址：

http://www.mgc.ac.cn/VFs/download.htm

官网地址：

http://www.mgc.ac.cn/VFs/main.htm

12、PHI

This database contains expertly curated molecular and biological information on genes proven to affect the outcome of pathogen-host interactions. Information is also given on the target sites of some anti-infective chemistries.

最新版本：

Version 4.3 （最近一次更新在2017年5月）

参考文献：

PMID: 16381911

下载地址：

http://www.phi-base.org/downloadLink.htm

官网地址：

http://www.phi-base.org/

13、HUMAnN

HUMAnN is a pipeline for efficiently and accurately determining the presence/absence and abundance of microbial pathways in a community from metagenomic data. 

参考文献：

PMID:22719234

下载地址：

https://bitbucket.org/biobakery/humann/downloads/

官网地址：      http://huttenhower.sph.harvard.edu/humann

Bioinformatics

老司机点评 

宏基因组功能注释主要是基于上面得到的非冗余的基因集，利用比对软件和各功能数据库进行比对。比对软件和比对结果的筛选同物种注释类似，比对软件主要有BLAST和DIAMOND，结果的选择有best blast hit和LCA 两种策略，这里多直接选择best blast hit作为最终比对结果。

在功能数据库的选择上，林林种种的功能数据库估计得有百余种，需要结合实际样品和项目情况、科学问题等选择适合的功能注释数据库。这里列出了一些相对较为常用或有特色的数据库，比如KEGG，最优的地方在于拥有描绘已知通路的代谢通路图，另外，KEGG的MGENES数据库包含了海洋、人体等不同环境的微生物功能信息（http://www.genome.jp/mgenes/），专为宏基因组数据分析使用，可以一试。此外，还有关注碳水化合物酶的CAZy，关注直系同源基因的COG、关注已验证蛋白信息的Swiss-Prot，关注毒力因子的VFDB、PHI等，关注蛋白结构域的Pfam、Resfams等等，此处不一一列举。

值得注意的是抗生素抗性基因数据库（注意是抗抗生素的基因而不是抗生素基因）的选择，ARDB自09年就不再更新，官网已挂上推荐大家使用接受志愿者数据而持续有更新的CARD。此外，以CARD的抗药基因数据为核心，结合隐马可夫模型构建的蛋白结构域预测数据库Resfam也在抗生素抗性基因研究中应用很多。

这里再介绍一下HUMAnN软件，可以说是HMP官方指定代谢分析工具。可以直接基于reads mapping进行KEGG，COG，NOG，PFAM等功能分析。比如分析代谢通路（KEGG pathway+module，MetaCyc pathway）的丰度和覆盖度，GO、PFAM、eggNOG、KO和EC的功能丰度等，十分好用。

07

binning

binning软件

1、CONCOCT

CONCOCT “bins” metagenomic contigs. Metagenomic binning is the process of clustering sequences into clusters corresponding to operational taxonomic units of some level.

最新版本：

Version0.4

参考文献：

PMID:25218180

下载地址：

https://github.com/BinPro/CONCOCT

官网地址：

http://concoct.readthedocs.io/en/latest/#

2、Meta-BAT

最新版本：

Version 2.12.1（最近一次更新于2017年9月）

参考文献：

PMID:26336640

下载地址：

https://bitbucket.org/berkeleylab/metabat/downloads/

官网地址：

https://bitbucket.org/berkeleylab/metabat

3、Canopy

A DA method called Canopy was used to reconstruct microbial and phage genomes, and plasmids, using co-abundance patterns across multiple samples.

参考文献：

PMID:24997787

下载地址：

https://github.com/ fplaza/mgs-canopy- algorithm

4、COCACOLA

A general framework automatically bin contigs into OTUs based upon sequence composition and coverage across multiple samples which is s scalable and faster than CONCOCT ,GroopM, MaxBin and MetaBAT.

参考文献：

PMID: 27256312

下载地址：

https://github.com/younglululu/COCACOLA

5、GroopM

An automated tool for the recovery of population genomes from related metagenomes.

参考文献：      

PMID:25289188

下载地址：

www.github.com/minillinim/GroopM

6、MaxBin

An automated binning algorithm to recover genomes from multiple metagenomic datasets.

最新版本：

MaxBin 2.0

参考文献：

PMID:26515820

下载地址：

http://sourceforge.net/projects/maxbin/

binning评估

7、CheckM

Assessing the quality of microbial genomes recovered from isolates, single cells, and metagenomes.

参考文献：

PMID: 25977477

下载地址：

http://ecogenomics.github.io/CheckM/

Bioinformatics

老司机点评 

在之前的文章《句句干货！一文读懂宏基因组binning》中对宏基因组binning做了比较系统的介绍。根据基于聚类的序列类型的不同，暂且分为reads binning， contig binning和 genes binning， 由于核酸组成和物种丰度变化模式在越长的序列中越显著和稳定，基于contig binning效果可能更好，现在的很多软件也是基于contig binning。

Contig binning的软件有不少，如CONCOCT、ABAWACA、Canopy、MaxBin、MetaBAT、GroopM、COCACOLA等，在去年发表的一篇文章中也有详细比较【PMID:26951112】。

Binning软件比较

这些软件中，目前比较主流和经典的是CONCOCT软件，2014年推出，目前引用量达到105；还有Meta-BAT 和 Canopy 资源消耗比较低，相比于其他binning软件资源消耗都比较大，这是一个很重要的优势。

Binning完成后，可以用CheckM软件对binning结果进行评估，得到completeness和contamination两个指标。

之后就可以做基于bins的单菌组装了。对于组装软件，常用的组装软件SOAPdenovo，Velvet，Ray和ABySS 等都可以，不过基于binning得到的bins进行组装，序列深度可能会比较低，可以选用适用于低深度测序的组装软件，比如Spades软件。

／End.

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