Circular RNA研究必读干货
2017年8月10日，国际著名杂志Science上在线发表了题为“Loss of a mammalian circular RNA locus causes miRNA deregulation and affects brain function”的文章。该文章的通讯作者为德国医学系统生物学研究所的Nikolaus Rajewsky教授。
最大的亮点在于第一次在小鼠中利用CRISPR-Cas9技术敲掉表达环形RNA Cdr1as，并着重分析CDR1as缺陷鼠的表型和这种表型产生的机制。
下面的内容，我主要想讨论近几年来研究的比较火的环形RNA。
环形RNA是一类大量存在于真核生物体内的保守的RNA分子，它的3’ 和5’ 端通过共价键的形式连接在一起形成环状结构。目前的研究表明，环状RNA主要来自于pre-mRNA的剪切。上游的称剪切受体和下游的剪切供体通过一种向后剪切的方式形成环状RNA分子。
环形RNA的发现
早在上世纪90年代就有实验验证人的DCC基因可以产生四种类型的环形RNA。另一个比较著名的例子为小鼠的sry基因产生的环形RNA。在发育的小鼠的生殖脊中sry基因产生的是线性的转录本，sry基因在小鼠胚胎发育过程中性别决定起到很重要的作用。然而在成年小鼠睾丸中，发现sry基因可以产生一个1.23kb的环形转录本。
近几年陆续有circularRNA的文章被报道。如人EST-1基因，人和大鼠P450基因，大鼠Shbg基因，果蝇mbl基因可以产生环形RNA，最有名的当属CDR1基因反义链上发现的环形RNA，称之为CDR1as 或ciRS-7。
最初这些环形RNA被认为可能是错误的剪切的产生的可能致病的副产物或者是由于转录、剪切的噪音。
随着高通量测序技术和生物信息学技术的发展，研究者发现circular RNA大量存在于人类，小鼠，果蝇，秀丽线虫等多细胞真核生物中。Jeck等在2013年报道在人的成纤维细胞中发现了25000个独特的稳定存在的环形RNA。这些RNA来自于14.4%的表达基因。有研究估计环形RNA可能占到人类总RNA的1%。
最近在人类，小鼠，果蝇，线虫等物种中的测序结果表明，环形RNA是一种进化上保守的分子，并且它有很强的细胞类型和基因时空的特异性。大部分的环形RNA表达量很低，然而部分的环形RNA表达量却很高，甚至比它的线性转录本要高的多。这些高表达的环形RNA可能参与了神经分化，神经系统形成等功能。这些结果表明，大量存在的环形RNA可能在整个生命活动过程中起着多种作用。
环形RNA的形成
1、 向后剪切
Jerk等在文章中指出环形RNA形成的机制可能有两种：套索驱动环化和内含子配对驱动环化。目前比较认可的是内含子配对驱动的环化。在此机制中，参与形成环的外显子两端的内含子中存在着反向互补序列，通过反向互补序列之间的配对，空间上拉进使得5’剪切供体和3’剪切受体相互作用形成共价键从而形成环形结构。
向后剪切通过这种“头尾结合”的方式形成的特殊的序列不存在于线性转录本中，这成为发现环形转录本的关键。由于不存在5’帽子结构和3’尾巴，所以它不同于线性转录本，不容易被核酸外切酶降解。这种向后剪切的方式似乎依赖于经典的mRNA前体剪切机制。
图片来自：Circular RNAs area large class of animal RNAs with regulatory potency
2、调控环形RNA形成的蛋白因子
反式作用因子也能参与环形RNA的形成，比如RNA结合蛋白（RBPs）。Quaking蛋白（QKI）的缺陷会导致精神分裂症等疾病。QKI蛋白结合在内含子上的结合位点，通过形成二聚体，促使环形RNA的形成。有趣的是，当敲减QKI后，环形RNA的表达量明显的降低，将QKI蛋白结合位点整合进线性转录本可以促进外显子成环。
以上的结果表明，QKI蛋白在环形RNA的形成过程中起到很重要的作用。另一种RNA结合蛋白ADAR1与QKI作用相反。在人类细胞中，ADAR是一类RBP蛋白，它的功能是在RNA编辑中将腺嘌呤去氨基后形成肌苷（inosine）。
ADAR对哺乳动物的生长发育很重要，ADAR敲除会导致胚胎致死。在内含子配对驱动的环化过程中，ADAR会识别内含子的互补区域将腺嘌呤脱氨基，是的这种结合效果变弱，导致成环效率降低。
环形RNA的功能
目前关于环形RNA功能的报道还比较少。大多数的功能都是特定的环形RNA分子的功能。
图片来自Loss of a mammalian circular RNA locus causes miRNA deregulation andaffects brain function
1、miRNA sponge
有些环形RNA序列上存在着特定microRNA结合位点。它可以吸附microRNA从而起到像海绵一样的作用，最为经典的例子就是CDR1as。CDR1as ( antisense to the cerebellar degeneration-related protein 1transcript)是小脑变性相关蛋白1（CRD1）基因反义链上产生的环形转录本。它的序列上有超过70个miR-7的结合位点，能够与miR-7和Ago-2蛋白形成RISC复合物。
研究发现，CDR1as主要定位在细胞质中，这与microRNA定位一致。如果敲低CDR1as或者过表达miR-7都能够促进miR-7靶基因的降解。斑马鱼中不存在CDR1as，如果在斑马鱼中过表达CDR1as后，会发现斑马鱼中脑体积明显减小，这与在斑马鱼中敲低miR-7的现象一致。因为现在已知的大部分环形RNA都定位在细胞质中，所以会不会存在大量的环形RNA可以作为microRNA的海绵来行使功能呢？
2015年Guo等人分析发现，环形RNAA作为microRNA的海绵只是部分特例，因为大部分的环形RNA并没有多个同一种microRNA的结合位点。研究发现，只有在果蝇的环形RNA序列中才有多于1000个各种microRNA的结合位点，这表明或许在果蝇中，环形RNA可以在整体水平上作为microRNA海绵的作用来行使功能。
2、RBP sponge
除了能与microRNA结合，环形RNA也可以结合特定的RNA结合蛋白，调控RNA结合蛋白和它的靶标RNA的相互作用。在果蝇中，mbl基因对果蝇的肌肉发育和眼部光感受体发育至关重要，Mbl表达缺陷会导致胚胎致死。作为环形RNA的调控蛋白，MBL蛋白可以促进自身mRNA前体的第二个外显子成环。
在低浓度的MBL蛋白存在时，mbl转录本以经典的剪切方式产生线性mRNA，翻译成MBL蛋白。在MBL浓度较高的情况下，MBL蛋白结合到mbl前体RNA上，促使第二个外显子形成环形mbl分子（circMbl），从而阻止产生更多的MBL蛋白，起到一种负反馈调节的作用。所以，环形RNA分子也可以作为RBP的海绵。
图片来自Circular RNAs: analysis, expression and potential functions
3、转录调控作用
有些环形RNA不仅仅只包含外显子，部分还包含有内含子。这类RNA是由单革教授课题组发现的，称之为EIciRNA(exon-intron circular RNA)。EIciRNA是一类定位在细胞核内的环形RNA分子，它通过调控RNA聚合酶II（RNAPolymerase II）来影响其线性RNA的表达。在对两个EIciRNAs，即 EIciEIF3J 和 EIciPAIP2 的进一步研究表明，它们都与亲本基因座以及 U1 snRNP 共定位，通过与 U1 snRNA 结合招募 U1 snRNP，进而促进RNA 聚合酶Ⅱ与亲本基因启动子区域的结合，顺式促进亲本基因的转录起始。
图片来自Exon-introncircular RNAs regulate transcription in the nucleus
环形RNA的翻译
环形RNA通常含有可以编的外显子或者是有开放阅读框，因此猜测环形RNA可能具有翻译功能。例如，体外合成的含有内部核糖体进入位点（IRES）的外显子序列的环形RNA时，体外实验和体内实验都表明这种合成的RNA可以被翻译。如果这种翻译产物真实存在于体内，那么这种特殊的蛋白产物可以存在很重要的生物学功能。然而目前仅有少量的报道称环形RNA可以与核糖体结合。
目前，越来越多的实验室开始关注环形RNA这个领域。
包括环形RNA的产生、功能、作用机制以及和疾病相关也一直是环形RNA的热门领域。期待环形RNA这个之前被认为是剪切副产物的物质逐渐的揭开它真正的面纱。
参考文献
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／End.
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