SOP文件 | 骨髓细胞分析显微镜法操作规程及临床意义

目的：

了解骨髓造血功能，有助于某些疾病的诊断，疗效观察、预后等的研究。

标本采集：

一般取胸骨，棘突，髂骨前嵴或后嵴等部位。两岁以内小儿主张用胫骨穿刺。穿刺部位不同，取材可能有明显的差异。以胸骨穿刺最好，棘突次之，髂骨最差。吸骨髓液一般不超过0.2ml，否则易于稀释。

检验的适应证：

1、诊断造血系统疾病；

2、协助诊断某些疾病；

3、提高某些疾病的诊断率。

仪器与试剂：

1、仪器：光学显微镜。

2、试剂：瑞氏-姬姆萨复合染色液

Ⅰ液：取瑞氏染粉1g、姬姆萨染粉0.3g，置洁净研钵中，加少量甲醇（分析纯）研磨片刻，吸出上层染液，再加少量甲醇继续研磨，如此连续几次，共用甲醇500ml，收集于棕色玻璃瓶中，每天早、晚各振摇3分钟，共5天，再存放一周即可使用。

Ⅱ液：PH6.4-6.8磷酸盐缓冲液

磷酸二氢钾（无水）6.64g

磷酸氢二钠（无水）2.56g

加少量蒸溜水溶解，用磷酸盐调整PH，加水至1000ml.

操作程序：

1、骨髓取材：由临床医生取材、涂片。

2、髓片两端用蜡笔划线，在血膜边缘较厚处用铅笔写明患者姓名及日期或编号。

3、染色程序：

1）髓片两端用蜡笔画线，置染色架上。

2）加Ⅰ液染液3-5滴于涂片上，静止1分钟（天热时间可缩短）。

3）然后加Ⅱ液磷酸盐缓冲液3-10滴，使两液混匀，约10-15分钟。

4）用水缓缓冲洗髓片，待干镜检。

4、普通光镜低倍镜检查：

1）、观察骨髓取材，涂片，染色情况。

2）、判断骨髓增生程度。根据成熟红细胞与有核细胞之比，可粗略地将骨髓增生程度分为五级判断标准如下：

增生极度活跃：成熟红细胞与有核细胞之比约为1：1，见于白血病、红白血病。

增生明显活跃：成熟红细胞与有核细胞之比约为10：1，见于白血病、增生性贫血。

增生活跃：成熟红细胞与有核细胞之比约为20：1，见于正常骨髓、某些贫血。

增生减低：成熟红细胞与有核细胞之比约为50：1，见于造血功能低下。

增生严重减低：成熟红细胞与有核细胞之比约为300：1，见于再生障碍性贫血。

判断的原则：当检验的结果介于两级之间时，则将其增生程度向上提一级。

3）估计巨核细胞系统增生情况：计数全部片膜内的巨核细胞。正常人于1.5cmX3cm的范围可见巨核细胞7-35个。但须在油镜下观察得以证实。

4）观察涂片边缘、尾部、骨髓小粒周围，有无体积较大或成堆分布的异常细胞，但也须在油镜下观察得以证实。

5、油镜检查：

1）选择满意的片膜段，观察200-500个细胞，按细胞的种类、发育阶段分别计数，并计算它们各自的百分率。

2）各阶段血细胞的形态学特征。（略）

3）观察各系统的增生程度和各阶段细胞质量和数量的变化，观察的要点：

① 粒细胞系统：观察胞体的大小、胞核的形态以及胞浆是否有空泡和变性、中毒性颗粒、Auer小体、吞噬物等。

② 红细胞系统：观察幼红细胞有无巨幼样变，胞核有无固缩、碎裂、胞浆内有无嗜碱性点彩、H0well-Jolly小体、Cabot环等，并应同时观察成熟红细胞大小、形态、染色、结构等有无异常。

③ 巨核系统：除作分类计数外，应注意巨核细胞和血小板的数量、大小、形态、及聚集性、颗粒变化等。

④ 单核细胞、淋巴细胞、浆细胞、网状细胞、内皮细胞、组织嗜碱细胞、吞噬细胞的数量和形态变化。

⑤ 是否出现其它异常细胞和血液寄生虫等。

6、结果计算：

1） 计算各系统各阶段细胞分别占有核细胞的百分率。

2） 计算粒红比例，将各阶段粒细胞百分率的总和与各阶段有核红细胞百分率的总和作比较，计算粒红比值（G/E）。

7、血象分析：分析骨髓象必须分析血象，因为两者可以互相对照，以增加诊断的正确性。

8、细胞化学染色：

用以协助鉴别诊断，常用的染色方法：

过氧化物酶染色、过碘酸-雪夫反应（糖原染色）、碱性磷酸酶染色、氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色、醋酸AS-D萘酚酯酶染色和氟化钠抑制试验、酸性磷酸酶和抗酒石酸酸性磷酸酶染色、铁染色。

9、填写检验报告单

1）取材、涂片、染色等情况：采用“良好”、 “尚可”、 “不佳” 三级评价标准。

① 取材良好的指标：骨髓液和涂片上均有骨髓小粒和脂肪滴。有造血的幼稚细胞的巨核细胞，有骨髓特有的细胞，粒细胞的杆状核与分叶核的比值大于血片中的比值。

② 涂片良好的指标：片膜厚薄适当、均匀，有头、体、尾三部分；尾部成弧形，上下缘整齐；面积约1.5cmX3cm；镜下见各类有核细胞分布均匀，成熟红细胞互不重叠，也不分散，也不皱缩。

③ 染色良好的指标：片上无染料沉着，细胞染色均匀，深浅适当，色泽鲜明，颜色正确。成熟红细胞染浅红色，粒细胞核分叶清楚，核染色质及胞浆颗粒清楚。

2）填写检验报告单：根据检验的结果，按报告单的要求，每项详细填写和描述。

3）提出诊断意见：根据骨髓象、血象、化学染色、结合临床资料提出具体意见，供临床参考。一般有以下几种情况

① 作出肯定诊断：若细胞学特征与临床表现均典型即可作出肯定诊断。

② 支持临床诊断：若骨髓象和血象的形态改变可以解释临床表现，即可提出支持性意见。

③ 排除某些疾病：若临床上怀疑是继发性血小板减少症，但骨髓象呈典型的原发性血小板减少性紫癫的表现，即可排除继发性的诊断。

④ 骨髓确有某些改变，但对临床诊断提出不支持或否定性意见，可简述其特点，并尽可能提出进一步检查的建议，供临床参考。

10、审核、核对报告单，签字、登记。

11、标本的保存：检验的标本和结果要妥善保存或存入档案，以备复查和总结。

涂片检查：

要求涂片均匀，有头，体尾三部分，血膜面积1.5cm*3.0cm，厚度以透过血膜可看清字迹为限。选择骨髓小粒部分制作涂片，骨髓液量不宜过多。此外，因为骨髓液中纤维蛋白含量高，凝固较快，所以涂片过程要快。

骨髓象检查的注意事项：

1、确认细胞不能单凭一、二个持点下结论。应综合细胞的大小、核质比例、核的形状、染色质结构、核仁、胞质着色和颗粒等条件全面分析判断。

2、不同染色法，细胞着色的深浅、酸碱度、染色质清楚程度等，不尽相同，因此判断细胞时，应结合同一涂片内其它正常细胞染色情况分析。

3、各系统的原始细胞虽各有特征，但极相似，除应作组化染色协助区别外，也可根据伴随出现的幼稚细胞或成熟细胞，推测原始细胞的归属。

4、介于两个阶段之间的细胞，应统一按成熟方向的下一阶段计算。

5、在特殊情况下介于两个系统之间的细胞的归属

1）介于浆细胞与幼稚红细胞之间的细胞，右归为红细胞；

2）介于淋巴细胞与红细胞之间的细胞归为红细胞（外周血中则归为淋巴细胞）；

3）若确诊为浆细胞性白血病、淋巴细胞白血病或红白血病时,应将这些细胞随确诊而划分归属。

6、实在难以确定的细胞，可列于“分类不明细胞”，可通过细胞化学染色、骨髓病理、电镜或集体读片等方法弄清类别，或作形态描述记录、照像记录、动态观察，以待进一步明确。急性白血病时，对破碎细胞应以观察和记数，以了解出现的比例的破碎的程度，为辩认和分析原始细胞类型作参考。

质量控制:

1、细胞识别符合率可接受性能指标：≥90％。

2、骨髓液中纤维蛋白含量高，凝固较快，所以涂片要快，但不可用草酸盐抗凝，否则会使血细胞核变形，核染色质致密，胞浆空泡形成、出现草酸盐结晶。

3、涂片要新鲜，应立即进行染色,如特殊情况，一般不超过一周。否则细胞蛋白质变性染色偏碱。

4、每批染液配制后使作前应用正常血片试染，以了解染液的性能。

5、染色时间长短与气温有关外，也与细胞增生情况、各批染液的性能有关，帮要求将染色中的涂片在显微镜下观察，待颗粒清楚、核浆分明、着色满意后才终止染色。

6、染色过深涂片可用瑞氏-姬姆萨复合染色液滴加于涂片上，马上冲洗。如过浅可重染，先加缓冲液，混合后复染到 需要的深度。

7、镜检时应考虑到一般体积大的细胞分布于涂片的上下边缘及尾部，计数时应从体尾交界处开始迂回向尾部移动。

8、骨髓巨核细胞计数涂片不宜过厚，以透过涂膜看到字迹为度，计数时应浏览全片。

参考范围：

分类结果归纳后符合下列情况时，可视为正常骨髓象。

1) 骨髓有核细胞增生活跃。

2) 粒红比值正常（2-4:1）.

3) 粒细胞系所占比例最大，约占40-60%，一般原粒细胞小于2%，成熟粒细胞中杆状核多于分叶核，嗜酸性粒细胞小于5%，嗜碱性粒细胞小于1%。

4) 红细胞系占骨髓第二位，约20%左右，原红细胞小于1%，早幼红细胞小于5%，以中，晚幼红细胞为主，平均各约为10%，无巨幼红细胞。成熟红细胞大小，形态正常。

5) 淋巴细胞占20%，难见到原始淋巴和幼稚淋巴细胞。

6) 单核细胞小于4%，主要是成熟阶段。

7) 浆细胞小于4%，主要是成熟阶段。

8) 巨核细胞，1.5cm*3cm髓膜可见巨核细胞7-35个，难见原始巨核细胞，其中幼巨核细胞0-5%，颗粒型巨核细胞10-27%，产板型巨核细胞44-60%，裸核8-30%。髓片约每25个成熟红细胞应有一个血小板，无异形和巨大血小板。

9) 非造血细胞，如网状细胞，吞噬细胞，组织嗜酸细胞等可少量存在，它们百分率虽然很低，但却是骨髓的标志。

10) 无异常细胞和寄生虫，不易见核分裂象。

临床意义：

1、粒细胞系改变：

1）增多：

（1）原始粒细胞增多：急性粒细胞性白血病，此时常伴有不同程度的早幼粒细胞的增多，原粒+早幼粒>30％；慢性粒细胞白血病急变，原粒+早幼粒细胞>30％，嗜酸和嗜碱性粒细胞可见增多。

（2）早幼粒细胞增多：M3型白血病，原粒＋早幼粒细胞>30％；粒细胞缺乏症的恢复期，但常<10％。

（3）中幼粒细胞增多：慢性粒细胞性白血病；M2b小型白血病，骨髓中以异常的中性中幼粒细胞增生为主，常＞30％;中性粒细胞性类白血病反应，除可见中幼粒细胞增多外，还易见中性晚幼粒细胞及杆状核细胞增多。

（4）中性晚幼及杆状核粒细胞增多：可见于慢性粒细胞性白血病、中性粒细胞性类白血病反应。

（5）嗜酸性粒细胞增多：变态反应性疾病、寄生虫感染性疾病及某些皮肤病、某些血液病，如慢性粒细胞性白血病、嗜酸性粒细胞性白血病、淋已瘤等。

（6）嗜碱性粒细胞增多：可见于慢性粒细胞性白血病和其急变期、嗜碱性粒细胞性白血病等。

2）减少：可见于再生障碍性贫血、粒细胞减少及缺乏症、急性造血停滞。

2、红细胞系的改变：

1）增多：

（1）原始及早幼红细胞增多：明显增多可见于急性红血病及红白血病、巨幼细胞性贫血、溶

血性贫血。

（2）中幼及晚幼红细胞增多：可见于各种增生性贫血，如溶血性贫血、缺铁性贫血、巨幼细胞性贫血、地中海性贫血、慢性病性贫血等。

（3）晚幼红细胞增多：可见于缺铁性贫血、慢性再生障碍性贫血等。

（4）巨幼红细胞增多：可见于巨幼细胞性贫血、应用抗代谢药物后等。

（5）铁粒幼红细胞增多：见于铁粒幼细胞性贫血。

2）减少：减少可见于再生障碍性贫血。

3、粒细胞与红细胞比值：

1）比值增高：可见于粒细胞系明显增多时，如粒细胞性白血病、急性化脓性感染等；红细胞系严重减少时，如单纯性红细胞性再生障碍性贫血。

2）比值减低：可见于红细胞系增多时，如各种增生性贫血；粒细胞系减少时，如粒细胞缺乏症。

4、淋巴系统的改变：

1）良性增生：主要见于血液病，如再生障碍性贫血、传染性淋巴细胞增多症、传染性单核细胞增多症、淋巴细胞型类白血病等；还可见于病毒性感染、百日咳等。

2）恶性增生：

（1）原始及幼稚淋巴细胞增多：可见于急性淋巴细胞白血病，慢性淋巴细胞白血病急变、淋巴瘤并发白血病时。

（2）成熟淋巴细胞增多：可见于慢性淋巴细胞白血病、高分化性淋巴瘤等。

5、单核细胞系的改变：

（1）良性增生：可见于活动性结核病、传染性单核细胞增多症、疟疾及粒细胞缺乏症等。

（2）恶性增生：可见于血液病，如急性单核细胞白血病，急性粒、单细胞性白血病及骨髓增生异常综合征等。

6、浆细胞系的改变：

（1）良性增生：可见于再生障碍性贫血、寄生虫感染、某些慢性细菌性感染、结缔组织病、粒细胞缺乏症等。

（2）恶性增生：可见于多发性骨髓瘤、浆细胞性白血病。

7、组织细胞的改变：

（1）良性增生：可见于某些感染引起的反应性组织细胞增多症，如结核病、病毒性肝炎、伤寒、败血症等。

（2）恶性增生：可见于恶性组织细胞病。

8、巨核细胞系的改变：

1）增多：

（1）特发性血小板减少性紫癜、Evan综合征、急性大出血、急性血管内溶血等。

（2）骨髓增殖性疾病，如真性红细胞增多症、慢性粒细胞性白血病、原发性血小板增多症等。

2）减少：

（1）可见于血液病，如再生障碍性贫血、急性白血病、骨髓纤维化、周期性血小板减少症等。

（2）其他疾病，如药物或化学物质中毒及放射病等。

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