建议收藏 | 8种新冠核酸异常扩增曲线详解
The following article is from 检验医学网 Author 黄斐
来源：检验医学网
作者：黄斐
审核：郭玮
单位：复旦大学附属中山医院检验科
实时荧光PCR技术是新冠病毒核酸检测的主要方法。每一个标本的检测结果都会以一张扩增曲线图呈现，需要我们的“专业慧眼”去辨析，判断出“阴性”还是“阳性”。在实际工作中，核酸扩增曲线并非次次“完美”，易受到多种因素影响。因此如何判读扩增曲线，对准确报告新冠核酸检测结果至关重要。
正常扩增曲线呈S型，分为基线期、指数起始期、指数扩增期和平台期，且要求拐点清楚，整体平行性好，基线平而无上扬现象。
异常扩增曲线是核酸检测人员最为头疼的问题。辨别扩增曲线形态、分析产生异常扩增曲线的原因是检测人员的必备技能。每一条扩增曲线的判读需要慧眼识别和经验处理。我们总结了检测过程中遇到过的异常扩增曲线，与大家进行分享。
01
内标扩增曲线异常
正常的内标扩增曲线是实验有效性的基础，可反映样本质量、抽提和扩增效率。
曲线特点：
【类型一】某标本内标无S型扩增曲线。
【类型二】外源性内标呈离散型曲线。
原因分析：
a) 标本采样欠佳，没有刮取到足够的鼻咽部细胞。
b) 标本保存不当，核酸降解。
c) 标本加错位置或漏加。
d) 提取失败：裂解液未混匀（外源性内标）、提取仪故障等。
e) 扩增失败：漏加反应液、模板加错孔位、混入抑制扩增反应的干扰物等。
解决方案：
a) 重新采集样本。
b) 送检标本及时检测，室温放置不超过4h。
c) 按照规范化流程进行相关操作。
d) 定期对在岗人员进行操作考核。
【注】内标扩增曲线异常，则该批或相应标本结果无效，需重新采样或重新检测。
02
基线设定不当的异常扩增曲线
曲线特点：软件默认基线设定的扩增曲线呈波浪型，导致Ct值偏大，可能会被误判为阴性。
原因分析：软件默认基线设定不准确造成扩增曲线异常。
解决方案：根据检测试剂的要求设定适宜的基线。
03
软件优化造成的异常扩增曲线
曲线特点：软件优化后扩增曲线向斜上方抬起，导致Ct减小，根据优化后扩增曲线会误判为阳性，但原始信号未有明显扩增。
原因分析：根据设定基线，软件在自动优化扩增曲线时会放大微小异常信号。
解决方案：查看原始曲线，对基线稍作调整。
【注】自动优化软件会放大微小的异常信号，可根据原始曲线判断信号真假。
04
多个标本单靶标通道翘尾
曲线特点：多个标本出现单靶标通道的扩增曲线翘尾。
原因分析：
a) 反应液配制后保存不当，如荧光探针断裂。
b) 存在阳性质控污染或者其他荧光物质污染。
c) 扩增试剂/耗材的批间差异导致非特异性扩增增加（如试剂更新后Mg2+浓度过高）。
解决方案：
a) 按照说明书要求保存配制的扩增反应液。
b) 提取得到的核酸应及时进行后续处理，否则及时封盖，避免混入阳性质控或其他干扰物；实验室每天按时清洁消毒以消除潜在的干扰因素。
c) 试剂/耗材批号更换前应进行比对实验验证。
05
靶标通道呈低平S型曲线
曲线特点：标本靶标通道呈低平且非典型S型扩增曲线，标本与弱阳性质控的荧光强度存在显著差异。
原因分析：
a) 标本存在干扰物质。
b) 提取纯化不完全。
解决方案：标本重新检测，必要时可使用不同的检测试剂进行确认。
【注】对疑似标本建议使用不同的检测试剂进行确认。在异常扩增曲线判断时，应根据整批标本的扩增情况（弱阳性质控扩增曲线）综合判断。
06
蒸发引起的异常扩增曲线
曲线特点：反应体系蒸发，终体积减少，荧光强度产生变化导致阴性扩增曲线整体呈斜向上或山域型。
原因分析：
a) 在扩增过程中因热盖导致管盖爆裂/光学膜破裂。
b) 未盖紧管盖/刮紧光学膜。
c) 未使用配套/质量合格的耗材。
解决方案：
a) 定期检查扩增仪状态，确保热盖温度正常。
b) 上机前盖紧管盖/刮紧光学膜。
c) 使用厂商推荐的合格扩增耗材。
d) 调整基线可适当纠正蒸发引起的异常信号，有助于后续的扩增曲线判读。
07
气泡引起的异常扩增曲线
曲线特点：扩增曲线出现剧烈或明显曲折。
原因分析：反应体系内有大气泡形成折射，干扰荧光的采集。
解决方案：
a) 加样时减少气泡的产生，同时上机前可通过离心减少气泡。
b) 调整基线可适当纠正气泡引起的异常信号，有助于后续的扩增曲线判读。
08
锯齿型异常扩增曲线
曲线特点：所有通道的扩增曲线出现锯齿状。
原因分析：扩增仪电压不稳、采光或者滤光片故障。
解决方案：检查扩增仪电压和光路系统，及时排除硬件故障，防止后续检测的异常结果。若扩增仪故障严重影响扩增曲线判读时应重新检测。
新冠核酸检测过程中每一个环节的操作都有可能产生异常扩增曲线，干扰结果判读。检测人员在上岗前需完成操作培训和考核，在实际工作中严格遵循规范化流程，掌握专业知识，积累实践经验，才能保证新冠核酸的检测质量。