临床NGS全流程共识（二）| 样品处理和实验室检测流程
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基因慧
文章/基因慧（公众号：GeneClub-1)
资料/中华医学遗传学杂志 编辑/Dylan
关键词/行业共识 封面图/杂志
划重点
1. 没有精准检测就没有精准医疗，目前临床基因检测实验室尚没有统一标准，部分仍沿用科研标准进行临床检测，亟需规范化，特别是技术细节、质量控制、质量评价的具体内容；
2. 实验室首先应遵守临床相关国内文件规范要求，实行分区，遵守生物安全要求；样本采集、运输与存储应根据不同样本类型进行操作，见文中表格归纳；
3. 质量控制包括核酸质控、文库质控、测序数据质控，特别是文库构建需评估试剂有效性，测序需评估不同试剂批次和固定时间间隔下的仪器损耗的稳定性；
4. 样本追踪包括性别一致性鉴定和SNP一致性鉴定；至少添加一个阳性质控、一个阴性质控或空白对照，与常规样本同时检测进行质量评价。
临床NGS全流程共识的由来
二代测序（NGS）已广泛应用于遗传病的临床检测。同时遗传病基因检测流程长、环节多、技术含量高，基因检测行业亟需在检测全流程规范化方面建立共识。
为推进基因检测行业的健康有序发展，配合相关部门和临床遗传专家组制订规范并落地实施，基因检测联盟（筹）组织临床专家、遗传学家以及第三方基因检测机构开展研讨会和指定行业共识。
2017年10月在深圳召开首届临床基因检测标准和规范研讨会，会后参会专业人士共同编写《临床基因检测报告规范与基因检测行业共识探讨》，于2018年2月发表在《中华医学遗传学杂志》（点击详情）。2019年5月在上海召开第二届基因检测联盟会议，会后形成《遗传病二代测序临床检测全流程规范化共识探讨》（简称“临床NGS全流程共识”）发表在近期的《中华医学遗传学杂志》（点击详情）。
临床NGS全流程共识涵盖技术要点和质量控制等，分为四个部分：1）遗传检测前流程；2）样品采集处理及检测；3）数据分析流程；4）检测报告解读和遗传咨询。
本文为共识的第二部分《样品采集处理及检测》的核心内容。作者介绍见下图。
△图： 共识第二部分作者及作者单位
（来源/《中华医学遗传学杂志》，制表/基因慧）
共识《样品采集处理及检测》内容
近年来，国内外二代测序市场竞争的参与者不断出现，不少公司均开展了基于二代测序的临床检测服务，如筛查染色体非整倍体的无创产前检测（non-invasive prenatal testing，NIPT）、肿瘤的个体化治疗等。相关行业规范和法规的出台，直接促进了NIPT检测市场的有序发展和繁荣。
遗传病的产前诊断及筛查、单基因和多基因遗传病的检测和咨询等也在成为一个重要的应用方向，因此也亟需一套覆盖实验室检测标准和管理规范的行业规范共识，指导将二代测序技术用于遗传病的临床诊断或筛查实验室，以提供稳定、可靠、有效的检测数据，用于临床辅助诊断或筛查工作。
本共识旨在为从事遗传病二代测序检测的实验室建立从样本采集到产生二代测序数据的全流程规范化管理提供指导。
1）应遵守的文件要求：
□ 总体设置与运行标准应符合：《临床机构实验室管理规范》（卫委发[2006]73号）。
□ 设计标准、工作基本原则以及注意事项应符合《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》（卫办医政发[2010]10号）及其附件《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则》的要求。
□ 实验室安全工作制度或安全标准操作程序应符合《实验室生物安全通用要求》（GB19489-2008）。
2）实验室分区原则
原则上，临床二代测序实验室应设置以下区域：样本接收与存储区、试剂存储与准备区域、样本制备区、文库制备区、扩增及测序区。这5个区域在空间上必须完全相互独立，拥有严格的工作区空气及人员流向，以有效防止样本核酸提取及建库扩增等过程所发生的污染。
3）生物安全基本要求
临床样本处理及制备区应符合生物安全二级实验室对于防护设备、个人防护和操作规范的要求。即使是普通的病理组织或血液样本，也可能存在病原体（如HIV、HBV、HCV等），存在导致操作人员被感染的风险。
4）二代测序实验室流程
二代测序检测的实验技术步骤包括患者样本的采集与运输、样本接收与存储，核酸提取，添加个性化分子标签，文库构建（包括核酸样本均一化、片段化、外显子组或特定区域靶向富集、接头连接、扩增、文库均一化）和上机测序，如图1示例。
1）样本采集注意事项
对不同的样本应采取不同的要求和标准来采集包含基因组DNA的生物样本，包括但不限于全血、唾液、干血片、组织和已提取的DNA等。
在样本采集前，应向受检者或其监护人介绍检测知情同意书的条款，指导其签署知情同意书。之后帮助或指导受检者或其监护人填写检测申请单，核对申请单与受检者的基本信息是否一致，检查受检者是否按照医嘱准备，并向其解释操作的目的以取得配合。
采集样本时，则需确认采血管上的受检者信息清楚，且与检测申请单上的信息一致。并标明受检者姓名、年龄、检测项目等信息。
2）样本的采集、运输与存储参考
△图： 样本的采集、运输与存储参考
（来源/《中华医学遗传学杂志》，制表/基因慧）
检测实验室的样本接收人员负责检查样本量、样本类型是否符合检测要求，并核查随样本寄送的检测申请单信息是否完整，并核对其与电子版本的一致性。建议一对一生成检测实验室内部编号，用于后续的实验流转，以保护受检者的隐私信息。
用于基因检测的样本应由医院长期保存（建议至少保存2年）。
1）DNA提取、质控、保存与内部转运
对于常规的二代测序检测，核酸抽提环节的质量控制需要考虑：DNA的A260/A280
值应在1.6~2.2之间，琼脂糖凝胶电泳结果DNA主带明显，无明显降解，无明显的蛋白质、多糖和RNA污染，这些是DNA定性分析结论最基本的要求。
核酸抽取剩余部分的DNA，若客户短期内没有返还样本的需求，建议检测机构对其妥善保管。DNA可短期保存在4℃（4周）或-20℃（1年），长期保存于-80℃（7年），且反复冻融不超过3次。
样本在实验室内部的转运，建议保证标签的一致性和可溯源性，采取可识别的编号，同时反映样本的不同状态
2）文库构建及质控
文库构建是整个二代测序进程中极为重要的一环，其质量的好坏将直接影响后续的测序数据质量。二代测序技术尽管发展迅速，但基因文库的构建仍是一项十分耗时且复杂的工作，无论使用哪种试剂用于临床基因检测，首先都应该有一套可靠的实验方法来评估其有效性，且需要经过一段时间的试用期来复验。
文库构建过程的质控包括：
（1）按已验证的检测流程实施文库的构建。首先应探索出有效且满足建库需求的最低起始建库DNA输入值，即检测限度。运用液相杂交捕获的方法，建议的样本起始量为200 ng；对于扩增子捕获实验，则建议以10 ng为起始量；
（2）建议在建库过程中同时设置空白阴性对照并使用标准品作为阳性对照。标准品可以选用商品化的细胞系标准样本或检测实验室已验证过的样本，用于监测实验室日常检测的可重复性和再现性，以及当批次临床样本检测的有效性；
（3）对构建好的文库进行质控时，需要根据不同项目的要求来监控文库的浓度或总量、产物片段的长度及分布、阴性及阳性对照的文库质检情况，并制定接受或拒绝的标准，以判定批次建库的成功与否。文库质控的具体标准需根据检测策略的不同制定出特异性的标准，不能一概而论。此外，建议将文库构建实验的中间产物保存1个月。
3）上机测序与质控
测序仪是基因测序的重要工具，目前市场上的二代测序仪主要包括Illumina、Thermo Fisher及华大智造等厂商提供的具有不同通量、读长及研究适配的测序仪器。
测序时应根据检测的样本量和质量要求，确定适宜的测序平台与方案，以保证临床遗传病的二代测序数据能够满足数据质量及靶向区域覆盖度等需求。实验室应具备满足测序仪的正常运行所必需的实验室洁净度、温/湿度、防震和光照等条件。
测序质量的参考值为：测序数据的单碱基质量评估指数（Q30）≥ 70%，同时文库复杂度的指示值重复读数百分比（duplication reads rate）也需要控制在一定的范围内，目标区域的平均深度应根据检测策略对基因变异判定所需的数据深度的需求而定。
二代测序的下机原始数据（BCL文件）建议保存0.5 ~ 1个月。FASTQ文件格式的数据保存的考量应包括原始数据的可溯源性、现有技术（包括测序技术、遗传变异位点处理技术）的版本可溯源性、基于目前知识注释解读的可溯源性及患者在一定时限内对数据的索取权，保存的时间和方式可视不同检测机构的情况而定，建议至少保存5年。同时，基于数据安全的考虑，应考虑实施必要的防火墙、加密和管理。
为确保在检测过程中样本无混淆或污染，建议检测机构设置样本追踪流程。在上传数据前，对数据与原始样本做强制性一致性分析，通过后方可上传数据用于后续的生物信息及遗传信息分析。
样本追踪流程包括两个方面：
1）性别一致性鉴定：将客户在临床信息中提供的性别信息与数据的性别分析得出的结果进行对比。如果结果不一致，则建议联系送检单位或个人来确定性别信息，同时检测机构应积累性染色体多倍性经验用于处理样本为非正常性染色体倍性相关的情况。
2）单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）一致性鉴定：建议选用多个SNP位点或其他标签作为样本的身份标识。首先通过设计的引物做DNA样本的SNP位点检测，待二代测序检测后对该样本数据中上述位点的SNP情况进行追踪比对，证明DNA样本与其产生的数据中SNP位点的一致性。
针对样本数据的污染问题，同时建议在生物信息分析阶段对数据的低频突变频率（low call variant ratio）进行监控。该指标若异常升高，也能够提示数据存在污染。针对上述追踪流程中异常结果的报告，检测实验室应在第一时间对失误进行原因分析，并及时采取应对措施或备选方案。
通常情况下，每次检测应至少添加一个阳性质控、一个阴性质控或空白对照与常规样本同时检测，并设定质控标准，保留质控记录。
同时，应该有计划地采用留样复测、相同样本相同人员不同时间重复实验、相同样本不同人员相同时间重复实验、不同方法相同样本的比对、设备定期核查等方式定期对检测系统的稳定性、仪器设备、人员等环节进行内部质控。
此外，开展遗传病二代测序临床实验室应每年或每两年参加由卫健委或美国病理学家协会（College of American Pathologists，CAP）组织的基因检测能力评估考核。作为室间质量评价的参考，如结果不合格，应当分析原因，并采取相应的预防或纠正措施。
本共识讨论涵盖了将二代测序技术应用于遗传病基因检测的整个流程。目前国内已有许多二代测序公司试水临床遗传病的检测，而对于涉及临床检测的实验室操作尚无统一的标准。
在临床实验室进行的规范化与标准化的检测与质控，有助于使遗传学专家或医师得到精确可靠、准确有效的检测数据进行分析，生成具有临床指导意义的遗传检测报告，进行准确的诊断并实施正确的治疗干预和产前诊断等。
尽管国际上发布了一些二代测序的指南和指导意见，我国也出台了相关的诊疗规范、共识，很多实验室也在遵从ISO 15189质量管理体系标准对实验室进行质量管理，但这些指南和意见往往并未涉及技术的具体操作以及如何做好质量控制的细节内容。在我国，二代测序临床实验室的质量管理仍有很多细节有待于完善。
本共识将为同行业的检测者提供参考，但更多的细节还需要相关的实验室通过不断的沟通与交流，确定普遍适用且有效的共识与标准。同时，实验室也应同临床医师与遗传分析人员保持互动，沟通内容包括从实验室获得检测技术策略选择的建议、检测技术性价比的评估、检测方案的适用性评价等，共同为遗传病二代测序实验室建立完善的检测共识，为提高遗传诊断检测的水平贡献力量。
（更详细内容请参阅《中华医学遗传学杂志》2020年3月第37卷第3期。）
参考资料：
1）曾秀凤，许振朋，黄辉等，《遗传病二代测序临床检测全流程规范化共识探讨（2）——样品采集处理及检测》，中华医学遗传学杂志，2020年3月第37卷第3期
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☆ 中国遗传学会生物产业促进委员会委员
☆ 连续三年发布权威的年度基因行业报告
☆ 发布首个基因行业信息平台优脉通YourMap
☆ 受邀为华西医院、Illumina、华大、上海交大等大会作报告
☆ 广东省精准医疗应用学会政策研究应用分会、遗传病分会常委
☆ 全国卫生产业企业管理协会精准医疗分会理事
☆ 第九届中国深圳创新创业大赛盐田区决赛评委
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