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土壤中分解尿素细菌的分离与计数讲义
（一）筛选菌株的原理
在选择培养基的配方中，把尿素作为培养基中的唯一氮源，原则上只有能够利用尿素的微生物才能够生长。
（二）统计菌落数目的方法
1.显微镜直接计数法：①原理：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物数量。②方法：用计数板计算。③缺点：不能区分死菌与活菌。
（1）原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
（2）操作：a.设置重复组，增强实验的说服力与准确性。b．为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。
（3）计算公式：每克样品中的菌株数＝(C÷V)×M，其中C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数。
特别提醒：①在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。如果某个平板的菌落数与其他差别甚远，说明该平板操作过程中出现失误，应舍弃。
②统计的菌落往往比活菌的实际数目低。这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。
③样品的稀释流程是将10g土样加入到90mL无菌水中得到稀释10倍的样液，从稀释10倍的样液中取1mL加入到9mL无菌水中得到稀释100倍的样液，如此进行梯度稀释。
（三）鉴定分解尿素的细菌
1.原理：细菌合成的脲酶将尿素分解成 NH3；由于NH3的产生，培养基碱性增强，pH升高，因此可通过检测pH的变化来判断该化学反应是否发生。
2.方法：以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌，若指示剂变红，则pH升高，说明该种细菌能分解尿素。
（四）目的菌种的分离与计数的操作步骤
土壤取样->配置土壤溶液和制备培养基->系列稀释->涂布平板与培养->菌落计数
解读：
1.目的微生物的寻找思路：根据目的菌对生存环境的要求，到相应环境中去寻找；筛选分离思路：人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时阻止或抑制其他微生物生长。
2.土壤是微生物的大本营，土壤中微生物有三大类群：细菌、放线菌和真菌；其样品稀释的标准为细菌：104～106，放线菌：103～105，真菌：102～104。
3.菌落特征：菌落性状、大小、隆起程度和颜色；成因：在一定的培养条件下，不同种微生物表现出各自稳定的菌落特征。
4.用空白对照证明培养基灭菌合格 ，直接培养未接种的空白培养基。
5.水体中的菌体数量计数：滤膜法；鉴别大肠杆菌的培养基：伊红美蓝培养基。
二、答疑难
（一）如何证明选择培养基的选择作用
说明：下列培养基配方3才符合以尿素为唯一氮源的要求。
（二）常用培养基的类型有哪些
牛肉膏蛋白胨（LB）培养基、营养琼脂培养基——培养细菌；麦芽汁琼脂培养基——培养酵母菌；马铃薯琼脂培养基——培养真菌；查氏培养基——培养霉菌；MY培养基——霉菌和酵母菌的传代保藏；伊红美蓝培养基——大肠杆菌鉴别培养基（大肠杆菌的菌落呈黑色略带金属光泽）；MS培养基——植物组织培养。
（三）纯化菌种的方法有哪些
（四）平板倒置的原因分析
1.平板冷凝后要将平板倒置的原因：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，将平板倒置，既可以防止皿盖上的水珠落入培养基，又可以避免培养基中的水分过快的挥发（注：空气流动速度减慢）。
2.接种后培养平板倒置的原因：将平板倒置，既可防止冷凝水滴到培养基上，避免杂菌污染；又利于菌种的生长、繁殖和计数（注：重力作用下营养物质在培养基表面富集）。
三、析典例
【例题1】（2019年，全国卷Ⅲ，第37题）回答下列与细菌培养相关的问题。
在细菌培养时，培养基中能同时提供碳源、氮源的成分是_______（填“蛋白胨”“葡萄糖”或“NaNO3”）。通常，制备培养基时要根据所培养细菌的不同来调节培养基的pH，其原因是__________。硝化细菌在没有碳源的培养基上__________（填“能够”或“不能”）生长，原因是______。 【答案】蛋白胨 不同细菌生长繁殖所需的最适pH不同 能够 硝化细菌可以利用空气中的CO2作为碳源
提示：一种物质能作碳源和氮源，必需同时含有碳元素和氮元素；硝化细菌属于化能自养型微生物。
【例题2】 空气中的微生物在重力等作用下，可以一定程度的沉降。某研究小组欲用平板收集教室空气中的微生物，以了解教室内不同高度空气中微生物的分布情况。实验步骤：① 配制培养基；② 制作无菌平板；③ 设置空白对照组和若干实验组，进行相关操作；④ 将各组平板置于37℃恒温箱中培养一段时间，统计各组平板上菌落的平均数。回答下列问题： （1）步骤③中，实验组的操作是______。
（2）若在某次调查中，某一实验组平板上菌落平均数为36个/平板，而空白对照组的一个平板上出现了6个菌落，这种结果说明在此次调查中出现了______现象。若将30(即36-6)个/平板作为本组菌落数的平均值，该做法_____(填“正确”或“不正确”)。
【答案】（1）将各实验组平板分别放置在教室不同高度的位置上，开盖暴露一段时间 （2）污染 不正确
提示：本实验的目的是了解教室内不同高度空气中微生物的分布情况。若空白对照组平板出现了菌落，则说明空白对照组的平板被污染。对照组平板出现污染，实验组平板不一定有污染或污染程度可能不一定与空白对照组的相同。所以，用实验组获取的菌落数的平均值减去污染产生的菌落数作为实验的结果是不正确的。正确的做法是：在防止污染的情况下重新实验，以获得较准确的数据。
【例题3】 图1是从土壤中筛选产脲酶细菌的过程。
（1）图中选择培养基应以______为唯一氮源；鉴别培养基还需添加______作指示剂，产脲酶细菌在该培养基上生长一段时间后，其菌落周围的指示剂将变成_____色。
【答案】（1）尿素 酚红 红 （2）1.75×108 少
提示：统计的菌落数应介于30～300，所以，选择细菌菌落数为156、178和191的平板计算出平均菌落数，即使(156+178+191)÷3=175，每克土壤样品中细菌数量为175÷0.1×105=1.75×108个。由于两个或多个细菌连接在一起时，在平板上往往形成一个菌落，因此，统计的菌落数要少于样品中活菌的实际值。
四、练变式