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酵母细胞的固定化讲义
一、过基础
（一）固定化酶与固定化细胞
1. 定义
固定化技术包括固定化酶和固定化细胞技术，它是指利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术。
2. 方法
（1）化学结合法：利用共价键、离子键将酶分子或细胞相互连接起来，如图①所示。
（2）物理吸附法：吸附在载体表面，如图②所示。
（2）由于固定化细胞固定的是完整的细胞，因而酶的环境较稳定所以对酶的活性影响较小，更能抵抗外界环境的变化。
（二）固定化酶的应用实例——生产高果糖浆
1.反应原理
将葡萄糖转化为果糖的酶是葡萄糖异构酶。
2. 操作过程
（1）使用固定化酶技术，将葡萄糖异构酶固定在一种颗粒状的载体上。
（2）将这些酶颗粒装到一个反应柱内，柱子底端装上分布着许多小孔的筛板（注：酶颗粒无法通过筛板的小孔而反应溶液却以自由出入）。如图所示：
注：①是固定化酶，②是反应柱，③是筛板
（3）葡萄糖溶液在流经反应柱时，与固定化葡萄糖异构酶接触，转化为果糖。
3.生产优势
实现了酶的连续使用，大大降低了生产成本，提高了果糖的产量和质量。
（三）固定化细胞的应用实例——固定化酵母细胞并用于发酵
1. 制备固定化酵母细胞的实验
（1）操作过程
（2）凝胶珠质量的鉴别方法
①挤压法：用镊子夹起一个凝胶珠放在实验桌上用手挤压，如果凝胶珠不容易破裂，没有液体流出 表明凝胶珠制作成功。
②摔打法：在实验桌上用力摔打凝胶珠，如果凝胶珠很容易弹起，表明制备的凝胶珠是成功的。
③根据凝胶珠的颜色鉴别：如果制作的凝胶珠颜色过浅、呈白色，说明海藻酸钠的浓度偏低，固定的酵母细胞数目较少；如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，则说明海藻酸钠的浓度偏高，制作失败，需要再作尝试。
2. 用固定化酵母细胞发酵
（1）冲洗:将固定好的酵母细胞（凝胶珠）用蒸馏水冲洗2~3次。
（2）发酵:150 mL 质量分数为 10% 的葡萄糖溶液 →200mL锥形瓶 → 加入固定化酵母细胞 →25 ℃ 发酵24h。
（3）检测：观察是否有气泡产生，闻闻是否有酒味。
二、答疑难
1. 与固定化酶相比，固定化细胞虽然使酶的催化活性得到很好的保留，但其反应效率为什么会降低?
答：包埋法固定细胞，由于包埋物或半透膜具有一定的空间或立体阻碍作用，使得反应物不易与细胞中的酶接近，尤其是大分子物质，所以反应效率会下降。
2. 固定化细胞时，要在反应溶液中加入营养物质，而固定化酶却不需要，这是为什么?
答：在固定化酶的应用实例中，单纯的酶没有生命活性，反应溶液中只需要加入酶的底物；在固定化细胞的应用实例中，要保持细胞的正常生命活动，反应溶液中除需要加入反应的底物外，还应加入满足细胞生命活动所需要的营养物质，并控制好环境条件（无菌、氧气等）。
3.若形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，成长条状或拖着小尾巴，其原因是什么?
答：可能是由以下3个原因造成的：①海藻酸钠的浓度偏高；②滴加混合液速度过快；③滴加混合液高度太低。
4. 在固定化酵母细胞的过程中，氯化钙溶液有什么作用?为什么要控制好氯化钙溶液的浓度?
答：因海藻酸钠与氯化钙反应后形成多孔隙网络结构的海藻酸钙凝胶结构，且海藻酸钙不溶于水，故能将细胞固定并使其具有一定的机械强度。氯化钙在实验中起到的是交联剂的作用，其中起主要作用的是钙离子。然而除钙离子外，大多数的多价阳离子（镁、汞除外）也可与海藻酸钠形成海藻酸盐凝胶。
此外，在配制氯化钙溶液时，若钙离子浓度过低，则形成凝胶珠的速度缓慢，且机械强度较低，包埋的细胞容易漏出；若钙离子浓度过高，则会引起细胞脱水，导致部分酵母菌丧失活性，且氯化钙溶液饱和后呈现浑浊状态，不易进行固定化操作。
三、析典例
（一）判断题
【典例1】判断正误
1. 固定化酶的主要目的是实现酶的重复利用（ ）
2. 化学结合法比物理吸附法对酶活性影响更小（ ）
3. 固定化细胞是可以催化各种反应底物的一系列反应（ ）
4. 反应物是大分子物质时最好采用固定化细胞技术（ ）
答案与分析：1 .√
2 .× 分析：化学结合法可能影响酶的活性部位，物理吸附法则不影响酶的分子结构。
3 .× 分析：每种固定化细胞固定的是一系列特定的酶 可以催化一系列特定的化学反应，而不是催化各种反应底物的反应。
（二）简答题
（1）该上述实验中的海藻酸钠作用是_________，CaCl2的作用是___________。
（2）为洗去凝胶球上残余的CaCl2和其他污染物，并保持绿球藻活性，宜采用_______洗涤。图1中1.0%海藻酸钠组培养24h后，移去凝胶球，溶液呈绿色，原因是___________。
（3）为探索固定化藻对含Zn2+污水的净化作用，应选用浓度为_______海藻酸钠制备凝胶球。
答案：（1）包埋绿球藻（包埋剂） 与海藻酸钠反应形成凝胶球（凝固剂）
（2）培养液（生理盐水）海藻酸钠浓度过低（凝胶球孔径过大）
（3）2.0%
解析：（1）海藻酸钠在固定化绿球藻的过程中作为包埋剂。CaCl2可与海藻酸钠反应形成凝胶球。
（2）利用培养液或生理盐水等洗涤凝胶球不至于造成绿球藻过量吸水或失水，从而保持正常的活性状态。 1.0％海藻酸钠组移去凝胶球，溶液呈绿色，说明绿球藻逸出了凝胶球，原因是制备凝胶球时，使用的海藻酸钠浓度过低，导致凝胶球孔径过大。
（3）图1显示，在不同浓度的海藻酸钠的作用下，当海藻酸钠浓度为2.0％时，固定化的绿球藻数量最多，故探索固定化藻对含Zn2+污水的净化作用，应选用浓度为2.0％的海藻酸钠制备凝胶球。