【瀚海数据说】这些生物医学创新能否帮助我们战胜新冠病毒？
The following article is from 礼来亚洲资本 Author 金淘沙拣
第311期
朱勇，笔名“金淘沙拣”，89年入学科大，5年里曾辗转于三个系：工程热物理、零零班（少年班）、生物系。其中在零零班年头最长。94年留学美国，后获得University of Kentucky药理学博士，Pepperdine University的MBA。做过科研、股票分析、和商务拓展。平时喜欢打篮球、读书、和发呆。他是University of Kentucky篮球队的忠实球迷。
图1. 新型冠状病毒
图片来源：https://www.cdc.gov/media/dpk/diseases-and-conditions/coronavirus/coronavirus-2020.html
这段日子我们每个人都在密切关注着新冠病毒肺炎的疫情。与2003年的非典时期相比，今天我们所处环境的最大不同除了微信的广泛使用外，还有生物医学技术在过去17年间的不断进步，我们因此拥有了一些对付新冠病毒的潜在的新式武器。这些创新的一个共同优势是开发周期短，可迅速量产，比传统手段更适合于应对新发传染性疾病。只是，要把这些创新具体地应用到控制新冠病毒肺炎上需要时间，需要医药界的投入，更需要政府、社会、公益组织的大力支持。在此让我们简单探讨一下近几年来涌现的几个生物医药创新技术。
预防: mRNA疫苗
2020年1月23日，美国Moderna公司宣布将开发针对新型冠状病毒（2019-nCoV）的mRNA疫苗。该项目由流行病防范创新联盟（CEPI） 资助，合作方还包括美国国立卫生研究院（NIH）。
Moderna以专注开发mRNA药而闻名，而其药物管线中技术风险最低的几个项目就是mRNA预防性疫苗。这几个项目又分为两大类：第一类是有商业前景的感染预防项目，针对巨细胞病毒（CMV）、呼吸道合胞病毒（RSV）、人类偏肺病毒（hMPV）和3型副流感病毒（PIV3）等；第二类是带有公益性质的新发瘟疫项目，针对塞卡病毒（ZIKV）、流感病毒（H7N9型和H10N8型）和基孔肯雅病毒（CHIKV）等。
让我们以CMV疫苗项目为例，来具体看一下Moderna的mRNA疫苗技术。CMV通过其病毒颗粒表面的gB蛋白和五聚体蛋白复合体感染人的成纤维细胞、上皮细胞和内皮细胞。Moderna团队把表达这6种病毒表面蛋白（gB和形成五聚体的5种蛋白）的6种mRNA分子一起包装进一个脂质纳米颗粒（LNP）中，再以LNP为载体将其递送进体内细胞中。这6种mRNA分子在细胞内与核糖体结合，翻译出6种蛋白抗原。这些蛋白再被运送到细胞表面，组装成gB和五聚体。这样，内吞了外源mRNA的细胞就“伪装”成被CMV病毒感染了的细胞，激活免疫系统，使人体获得了对CMV的免疫力。
与其它形式的疫苗（灭活或弱化病毒、蛋白、DNA）相比，mRNA疫苗具有以下几个优势：
1） 一次接种可以使人体获得更强大更持久的定向免疫力；
2） 抗原的设计可以更准确更灵活；
3） 可以表达几乎任何膜蛋白、可溶的或多聚体蛋白抗原；
4） 生产mRNA疫苗不需要培养病原体；
5） 可以迅速批量生产；
6） 可以采取灵活的库存方法，包括冷冻质粒文库和未剂型化的mRNA，以应对将来的瘟疫威胁；
7） 平台一旦建立，针对任何新发感染病的疫苗可以迅速开发出来。
然而，Moderna在建立mRNA药物平台时要克服许多技术障碍：
首先，mRNA是比蛋白药大得多的分子——若想表达一个分子量为30KD的蛋白，其修饰过的完整的mRNA分子接近600KD。如何把这么大的分子递送到细胞里是第一个要解决的问题。
其次，未加修饰的mRNA会被人体免疫系统所排斥，还没有翻译成蛋白之前就已被破坏掉。如何保护mRNA分子是第二个需要解决的问题。
通过修饰逃过免疫系统的mRNA进入细胞后，又要和天然的mRNA分子一样与核糖体结合，翻译出蛋白。如何能设计出不引起免疫应答、又有正常功能的mRNA分子是第三个技术问题。
此外，mRNA的测序、提纯、分析、二级结构测量、检验也有很多技术难关需要攻克。Moderna经过几年的攻关，已成为这一平台技术的权威，并在多个项目上获得良好的临床数据，展示了mRNA药的广阔应用前景。
2020年1月31日，另一家mRNA公司CureVac宣布，他们和CEPI扩展了已有的合作协议，也将启动新冠病毒mRNA疫苗项目。CEPI将增加对CureVac的资助来支持这一项目。
mRNA疫苗技术非常适用于对新冠病毒感染的预防。当然，nCoV的mRNA疫苗的开发需要时间，不会一蹴而就。关于这点，文末将有简短讨论。
诊断：CRISPR分子诊断技术
随着Cas12、Cas13和Cas14等新的CRISPR系统的发现，张锋团队和Jennifer Doudna团队在最近几年创建了CRISPR分子诊断技术，用来检测RNA或DNA目标分子。张锋博士创立了Sherlock Biosciences公司，Doudna博士创立了Mammoth Biosciences公司，两个公司都专注于开发以CRISPR为基础的IVD技术。具体过程请详见《连环画 | CRISPR分子诊断技术》。
CRISPR分子诊断技术建立在Cas12、Cas13和Cas14的特性基础上。以Cas13a为例，Cas13a-crRNA的靶分子是入侵病原的单链RNA。Cas13a-crRNA一旦找到并结合匹配的RNA后，会进入激活状态，除了剪切靶RNA外，还大开杀戒，碰到任何单链RNA都可非特异性地将其剪切、降解。利用这一特性，Cas13a可以被用来构建高特异性、高灵敏度的RNA检测方法。若想检测出某一特定序列的RNA分子，先将与其互补的crRNA和Cas13a蛋白组装，再加上一些报告RNA分子。常用的一种报告RNA是一段寡核苷酸：一端附有一个荧光素（F），另一端有一个暗淬灭剂（Q）。由于Q的猝灭作用，一个完整的报告RNA分子不会发出荧光。当Cas13a-crRNA抓到特定的靶RNA（activating target RNA）时，Cas13a的非特异性RNA水解酶的活性会被激活，剪切报告RNA，其荧光素摆脱了Q的淬灭，释放出荧光。这样，通过荧光信号就可以检验出靶RNA的存在。
经过张锋团队和Doudna团队的不断改进，CRISPR分子诊断技术同其它分子诊断技术相比有几大优势：
1） 高特异性：可达到单碱基分辨度。
2） 高灵敏度：能够检测到渺摩尔浓度的靶分子。也就是说，即使一微升溶液里只有一个靶DNA或RNA分子都可以被检验出来。
3） 由于DNA常温扩增技术（RPA）的引入和金标格式的开发，CRISPR分子诊断技术可以做到真正的“仪器自由”，不需要PCR仪，不需要荧光检测装置。诊断使用和验孕棒一样简单、方便。
4） 诊断时间短：从患者样品处理到读取结果在一个小时内完成。
5） 开发周期短：2017年9月，中科院遗传所的许执恒团队和军事医学科学院的秦成峰团队在Science上报导，塞卡病毒的prM蛋白的一个突变 (S139N) 增加了其传染性，并引起更严重的小头症和更高的死亡率。张锋实验室与哈佛的Pardis Sabeti实验室合作，在该论文发表后一周内，就已经设计、开发出几个能区分出S139N病毒突变的SHERLOCK分析方法，包括荧光或显色格式。
我们可以预测，如果开发出以CRISPR为基础的nCoV检测方法，新冠病毒的诊断瓶颈会得到很大改善。Endpoints News于2020年1月30日报道，Mammoth Biosciences正在开发新冠病毒感染的即时检测方法（POCT）。
治疗：中和抗体和超级抗体
因为我们每个人的抗体基因都不同，针对同一抗原，每个人都可能会产生与众不同的抗体。另外，由于单细胞分析技术和新一代DNA测序技术（NGS）的发展，许多制药公司现在已经能够从病毒感染痊愈者体内找到中和抗体（可抑制病毒感染、裂解细胞的的抗体）。如果幸运的话，我们还可以从这些中和抗体中找到超级抗体或bnAb：超级抗体不但能中和感染的病毒，还具有广度，能抵挡同一属的其它种病毒。这些中和抗体和超级抗体可以被开发成蛋白药，用来治愈病毒感染患者。具体信息请详见《连环画 | 超级抗体》。
单克隆抗体已被证明是一种有效的治疗病毒感染方法。2019年8月，由美国国家卫生研究院（NIH）、世界卫生组织（WHO）及其他政府、公益组织在刚果开展的临床试验初步数据显示，在4个实验药物中，REGN-EB3（在人源小鼠中找到的3个中和抗体）和mAb114（从1995年埃博拉幸存者体内找到的中和抗体）对埃博拉病毒疾病（EVD）的疗效明显优于ZMapp和Remdesivir，死亡率分别降至29%和34%。患者如果早期使用（症状出现4天之内）REGN-EB3和mAb114进行治疗，死亡率会更低，仅有6%和11%。Remdesivir（瑞德西韦）这几天成为焦点之一。它是由Gilead开发的小分子药，将在中国进行针对新冠病毒感染的三期临床试验。瑞德西韦对EVD有一定疗效，但效果不如其它单抗药。
我们可以借鉴EVD超级抗体MBP134的开发过程来研制新冠病毒的抗体药。从痊愈者的血液中通过单B细胞克隆技术分拣出表达不同抗体的B细胞，再筛选出能结合nCoV表面的S蛋白的抗体，然后从中找到中和抗体。大部分的早期实验不需要真正的nCoV，只需要重组S蛋白和组装病毒（表面表达S蛋白的安全病毒）。只有后期的动物实验和猴子实验因为要用到真正的病毒，那时P4等级实验室才成为必需条件。
一般来说，找到中和抗体并不难，耗时的往往是筛选超级抗体、抗体优化等步骤。如果时间紧迫，我们可以直接把中和抗体开发成抗体药。更理想的疗法是由靶向S蛋白不同表位的几种中和抗体组成的鸡尾酒疗法。
和其它药物疗法相比，源于志愿者的中和抗体的最大优势是安全性。由于它完全复制痊愈患者体内的抗体，中和抗体的毒性小，免疫原性弱，成药性强。中和抗体的另一优势是其开发周期短——避免了分子设计、免疫动物或构建大规模抗体库等步骤，有望在几个月内找到一些中和抗体，作为候选药物来进一步开发。
1月29日，药明生物宣布，他们通过国际合作，已在开发新冠病毒的中和抗体上取得了一些进展，并有望在4-5个月内完成全部开发工作。这是一个令人欢欣鼓舞的好消息。我们将继续关注。
讨论
由于药物开发的固有周期，很多人质疑现在开发新的疫苗或药物是否为时已晚。等抗病毒药走完临床前实验和临床试验，新冠病毒瘟疫很可能已经消失。以下是我的几点看法：
1） 没有人能准确预测疫情的发展。由于其传染性强、死亡率低，一种可能出现的情况是新冠病毒肺炎转变成人群慢性感染，成为另一种流感，每年爆发一次。我们必须做好一切准备，开发一切可以开发的武器，以防万一。
2） 即使疫情很快的得到改善，我们现在的开发工作对以后防治类似的感染病也会有帮助。如果Gilead没有针对埃博拉开发瑞德西韦，我们现在对新冠病毒就少了一个候选药物。从这一点上来说，超级抗体的开发尤为重要。MBP134对氨基酸序列保守度只有55%的几种埃博拉病毒属的病毒成员都有疗效。下一次冠状病毒感染爆发时，我们现在开发的超级抗体药或许就能派上用场。
3） 很多实验药物或疫苗在临床试验阶段就已经发挥了抑制疫情的作用。默沙东的V920疫苗虽然在2019年12月才被美国FDA批准上市，之前它在刚果已被广泛使用（compassionate use）来预防埃博拉——截至2019年9月已有将近20万人接种该疫苗。又比如，虽然到现在还没有被批准，ZMapp作为实验药物在缓解2014-2016西非埃博拉疫情上起了很大作用。
4） 生物制药公司开发新发传染病的疫苗或新药多半不会获得投资回报。这就需要政府和公益组织给与一定的支持。CEPI出资给Moderna和CureVac用来开发新冠病毒mRNA疫苗，就是一个很好的典范。
我们可以不让历史重演。医药人有责任把创新技术转化成抵抗瘟疫的武器。无论是个人，还是商业、政府或公益组织，在任何情况下，我们都应该hope for the best, prepare for the worst。让我们并肩战斗，共渡难关。
参考资料：
CureVac (2020). CureVac and CEPI Extend their Cooperation to Develop a Vaccine against Coronavirus nCoV-2019. Feldman, R. A., et al. (2019). "mRNA vaccines against H10N8 and H7N9 influenza viruses of pandemic potential are immunogenic and well tolerated in healthy adults in phase 1 randomized clinical trials." Vaccine 37(25): 3326-3334. Li, H. (2019). Characterization of mRNA - A Novel Modality for Therapeutic Antibody Engineering. Antibody Engineering & Therapeutics 2019. San Diego, CA. Lu, S. (2020). Overview and Analysis of the Novel Pathogenic Coronavirus Outbreak in China. 华人抗体协会Webinar. Moderna (2019). moderna R&D Day Presentation, 09/12/2019. Moderna (2020). Moderna Announces Funding Award from CEPI to Accelerate Development of Messenger RNA (mRNA) Vaccine Against Novel Coronavirus. 药明生物 (2020). 药明生物加速赋能多个抗新型冠状病毒中和抗体研发. 连环画 | 超级抗体 （2019/09/08） 连环画 | CRISPR分子诊断技术 （2019/07/17） Caliendo, A. M. and R. L. Hodinka (2017). "A CRISPR Way to Diagnose Infectious Diseases." N Engl J Med 377(17): 1685-1687. Amber Tong. "Doudna-founded CRISPR upstart bags $45M for new Cas research, extends its reach into therapeutics" Endpoint News 2020/01/30
编辑：牟志坚796/周连祥 9701
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