灌流系统中的产物质量属性漂移：如何在漂移发生时鉴定漂移
本文节选自来自美国Bayer公司的研究人员于2020年9月发表于《Bioprocess International》的文章“Product Quality Attribute Shifts in Perfusion Systems, Part 1: Identifying Shifts When They Occur”。值得注意的是，文中案例使用的细胞截留装置是重力沉降设备，这是一种在上世纪80-90年代使用较多的灌流技术，主要用于一些在生物反应器内滞留时间较长时会出现降解的产物的生产，如一些血液因子或酶，相比现在更广泛使用的基于中空纤维过滤器的细胞截留装置，特别是交替式切向流（ATF）设备，重力沉降设备的主要缺点是细胞分离效果相对较差，即不能达到100%的细胞截留，而且细胞在反应器外（即截留装置内）的滞留时间长，可能影响细胞培养性能。但文中对于产物质量属性出现漂移时，如何鉴定漂移发生的原因的流程仍具有相当的借鉴意义。详细内容，可参考原文。
灌流细胞培养是一种连续的工艺，通过细胞截留装置，不断地添加新鲜培养基，同时去除已消耗的培养基(收获)。为了维持特定的生物反应器细胞密度，通过细胞废弃，周期性地去除部分细胞。
图1. 哺乳动物细胞灌流培养系统的简单示意图。
相比批次和补料分批培养模式，灌流系统有多方面的优势，比如较低的资本成本，以及在更长的生产运行中，支持更高的细胞密度和活性的能力。然而，由于灌流系统需要使用细胞截留装置，需要复杂的操作监测和控制。
在稳态条件下，细胞灌流培养系统达到目标细胞密度，同时维持恒定的参数，如培养基补加和收获流速、细胞活性、pH和O2/CO2水平。通常在整个生产过程中保持这一点，细胞被期望产生始终如一的产品质量特性。这里我们讨论一个在稳态条件下进行的常规细胞培养运行的案例研究，其中，一个产物质量属性（PQA）在药物底物(DS)阶段被观察到出现非典型趋势 (图2)。对一系列细胞培养和纯化工艺参数的研究性分析显示，在这种情况下，细胞截留设备效率的下降导致了观察到的非典型PQA。
图2. 哺乳动物细胞灌流培养系统和随后的纯化工艺的案例研究概要；药物底物(DS)阶段出现非典型产品质量趋势。
案例研究：图2是哺乳动物细胞灌流培养系统和随后的纯化工艺的概况。在持续几个月的常规细胞灌流培养运行中，通常是在工艺达到稳态后开始收集收获液/产品。在这一常规的细胞培养运行中，在DS期(图2)观察到了非典型的PQA趋势。这种非典型趋势是低分子量(LMW)产物异构体水平呈上升趋势(图3a)，从该产物的体积排阻层析(SEC)趋势图的一个区域可见(图3b)。
图3. (a)低分子质量(LMW)药物底物开始呈现上升趋势(红色箭头)；(b)体积排阻层析(SEC)趋势图显示高分子量(HMW)、产物峰和低分子量区域。蓝色曲线为典型质量趋势图，而红色曲线显示非典型的质量趋势图，可观察到低MW物质出现上升趋势。
初步调查：图4所示为我们用于确定LMW出现上升趋势的根本原因的方法。我们的调查从确认所有关键工艺参数(CPP)在整个细胞培养和纯化过程中仍处于操作范围内开始。我们对原材料批次、二级供应商变更以及工艺变更进行了广泛的评估(图5)。这项工作包括使用原材料分析证书(CoA)进行多变量分析(MVA)。
图4. 用于确定造成LMW出现上升趋势的根本原因的研究方法。
结果：我们发现工艺和原材料变化之间没有相关性，因此排除两者作为LMW出现上升趋势的潜在根本原因(图5)。随后，我们将研究重点转移到LMW上升与PQA相关性上。因此，我们分析了所有DS PQA(如工艺步骤收率、蛋白质浓度、宿主细胞杂质浓度以及糖基化模式)与LMW趋势的相关性。分析结果表明，除亲和层析柱(ACC)的收率外，所有DS质量属性均保持典型趋势，且无相关性。
图5. 将原材料变异性、二级供应商和工艺变更作为非典型LMW趋势潜在原因进行了广泛的评估。
LMW与工艺步骤收率趋势的相关性：LMW的上升趋势与ACC工艺步骤收率的趋势间接相关(图6)。为确定或排除特定的ACC填料批次和/或包装批次(在纯化工艺中使用的批次)是LMW上升的根本原因，我们使用Tukey-Kramer方法进行了历史分析(> 500 DS大规模批次) (图7)。分析确认了LMW与ACC工艺步骤收率之间的间接相关性，也说明，存在的LMW水平影响了ACC工艺步骤的收率。因此，排除了特定ACC填料/包装批次的原因。
图6. DS阶段LMW和纯化中间体ACC工艺步骤收率趋势图比较显示，LMW的上升与ACC步骤收率下降具有明显的相关性。
图7. >500 DS大规模批次的历史Tukey-Kramer分析(1)证实了LMW与亲和层析柱(ACC)工艺步骤收率之间存在间接相关性。
然后，我们调查的关注点转移到了来自两座不同大楼(A和B)的纯化起始材料和细胞培养批次。我们绘制了来自两座大楼的DS LMW数据，如图8所示。LMW出现上升趋势只在于大楼A生产的细胞培养批次。因此，尽管LMW与ACC步骤收率之间存在间接相关性(图6和图7)，我们假设根源原因不太可能在于纯化链，因为如果这样的话，那么LMW上升趋势将发生在两个细胞培养来源。
图8. 以A、B大楼生产的细胞培养批次/时间（x轴）获得的药物底物批次的LMW数据(y轴)。
小规模研究排除了纯化工艺：为了确认大楼A生产的细胞培养批次是唯一需要考虑的因素，我们在规模缩小研究中，进一步评估了是否可以排除大规模纯化工艺是LMW出现上升趋势的原因。我们使用一个以大规模纯化工艺1/300缩小的模型进行了小规模研究。
如图9所示，在小规模的研究中，对照和测试(大规模)细胞培养批次都使用相同的规模缩小纯化工艺进行纯化。正如预期的那样，对照批次1和2都产生了典型的LMW值，而大楼A获得的测试细胞培养批次(图8)给出了更高的LMW值。因此，我们排除了大楼B的细胞培养批次是造成LMW高趋势的根本原因。
图9. 使用对照(1和2)和大规模细胞培养测试批次的小规模研究设计，使用相同的规模缩小纯化工艺纯化。
大楼A细胞培养操作的研究性分析：因为LMW的上升趋势出现在大楼A，而没有出现在大楼B，我们将调查范围缩小到大楼A的细胞培养操作，细胞培养参数(见下表)在整个细胞运行中呈现典型值或趋势。
多变量分析(MVA)：为了确定表中列出的参数是否影响了LMW的上升趋势，我们进行了MVA，发现三个参数的MVA趋势(图10)与LMW的上升趋势相关。这三个参数都是细胞截留性能的指标。
细胞废弃频率趋势与LMW趋势间接相关，而收获活细胞密度(VCD)和细胞培养聚集趋势均与LMW趋势直接相关。对大楼A的早期到中期阶段对细胞培养操作的进一步评估显示，培养基和收获流率发生了突然的变化/调整。培养基流速降低了10%，以配合有限的收获液存储容量。这一变动的流速仍保持在系统操作范围内，因此在操作期间没有被标记。
图10. 三种细胞培养参数的多变量分析(MVA)趋势 - 细胞废弃频率、收获液活细胞密度(VCD)以及细胞培养聚集 – 其与药物底物(产物质量属性)中的低分子质量(LMW)趋势相关。x轴表示细胞培养运行时间，y轴表示LMW趋势。数据点的配色与LMW值相关。蓝色对应较低的LMW值，从绿色到黄色再到红色的颜色强度增加对应向上漂移。
应用对细胞培养过程的理解：为了解释低培养基流速和LMW趋势上升之间的关系，我们将我们对细胞培养工艺的理解应用于MVA结果确定的三个参数趋势。随着灌流运行的进行，生物反应器中的细胞聚集增加。当细胞聚集增加时，细胞截留装置的性能开始降低效率，因为细胞在其中累积。这里需要注意的一个关键点是，生物反应器在相对较高的温度下运行，而细胞截留装置在相对较低的温度下运行。
确定细胞在细胞截留装置内滞留时间的增加是导致高LMW的根本原因：在运行的早期到中期阶段培养基流速降低后(结合通常会发生的细胞聚集)，细胞截留装置内的细胞累积极有可能显著增加，因为较低的收获和细胞返回流速(从细胞截留装置回到生物反应器)降低了细胞截留装置的性能。细胞截留装置内较高的细胞累积量导致更多的活细胞被扫入收获液流，因此需要的细胞废弃更少(图11)。由于与生物反应器相比，细胞截留装置在较低的温度下运行，我们推测，细胞在细胞截留装置内较低温度条件下的滞留时间的增加导致LMW出现上升趋势。
图11. 细胞截留装置中更高的细胞累积，导致更多的活细胞被扫入收获液流以及更低的细胞废弃频率。
小规模细胞培养研究：为了证实我们的假设，即细胞截留装置中细胞滞留时间的延长是导致更高的LMW趋势的根本原因，我们使用比大规模工艺小15倍的生物反应器进行了小规模细胞培养研究。我们在规模缩小模型生物反应器中进行了这项小规模研究，一个使用对照条件下(典型操作条件)，另一个使用试验条件(培养基流速突变10%)。规模缩小模型的对照和试验条件细胞培养批次使用按规模缩小的纯化模型进行纯化，如图9所示。
我们小规模研究的结果(见表1)证实了试验条件不仅导致了更高的LMW，而且导致下游工艺中更低的亲和层析收率。
原文：L.P.Pathange, Y.Shimoni, V.Srinivasan, Product Quality Attribute Shifts in Perfusion Systems, Part 1: Identifying Shifts When They Occur. Bioprocess International, 2020.
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