通过前期灌流和超高接种细胞密度，实现CHO强化补料分批培养
来自德国勃林格殷格翰制药公司的研究人员在2020年4月的《Bioprocess and Biosystems Enigineering》杂志上发表了题为"Pre-stage perfusion and ultra-high seeding cell density in CHO fed-batch culture: a case study for process intensification guided by systems biotechnology"的文章。文中，研究人员指出，治疗性蛋白质生产领域需要工艺强化策略，以提高产量、降低成本，同时优化设施利用率。故而，文章描述了一种工艺强化策略，其将基于切向流过滤的前期灌流工艺与以超高种子密度（uHSD）接种的浓缩补料分批生产培养相结合。该策略将生物质生产转移到前期，以灌流模式达到45x10^6cells/mL的密度。随后，以强化补料分批模式进行的生产立即开始，在与低密度接种相同的培养时间内，产物滴度接近翻倍（1.9倍），且产物质量相当。受机制建模和二代测序（NGS）的驱动，通过筛选培养基成分，降低灌流和生产培养中的细胞适应，从而对工艺进行了优化。作为主要的特点，强化方法中使用乳酸补液策略，以提高细胞培养性能，且工艺成功转移至中试规模，即10L前期灌流和80L生产反应器，证实了工艺的可放大性。此外，相比对照工艺，在uHSD培养中，证实基因表达模式更早从生长相关转变为生产阶段相关表达。总体来说，文章介绍了一种可获得更高单位体积产量的强化策略，适用于常用的商品化补料分批设施中，已有的或已经验证的分子。本文为原文内容简介，详细内容，请参考原文。
简介
单克隆抗体（mAb）和其它治疗性蛋白质是目前制药行业最重要的产品类别，且在未来数年仍可能保持主导地位。典型的工艺形式包括哺乳动物细胞表达系统，如中国仓鼠卵巢（CHO）细胞，以补料分批工艺培养，最终达到大体积的生产规模。对单克隆抗体治疗药物不增增加的市场需求以及降低其生产成本的压力，驱动了新的生产方法以及优化设施利用策略的开发，如连续生产。为执行不断提升的工艺强化技术，制药工艺可以通过构建新的生产工厂或强化现有的生产工厂，而进行规模扩展。两者策略都需要较大的资金投入，而且在设备安装和重新进行质量确认的过程中，需要在成本和停机时间之间进行平衡。对于完全连续生产工艺，很难在现有的补料分批工厂中实现，原因在于技术和法规方面的诸多问题，如更高的复杂性以及更多的培养基用量。开发和维持市场可接受的抗体产品的一种聪明做法，是使用强化策略，其利用可用的产能，解决生产链瓶颈，且可在现有的工厂中实施，如N-1灌流。
按Kloth等的描述，前期（N-1）灌流的概念是将生物质生产从资金投入较高的大规模反应器转移到更小的前期系统中来。细胞截留结合培养基置换可保证稳健的对数期细胞增殖，而不损失生物质，且这可通过多种技术实现，虽然技术的稳健性和可放大性略有区别。灌流工艺可达到100x10^6cells/mL以上的细胞密度，所以多个后续批次培养所需的生物质生产可结合到一个灌流阶段中。也就是说，种子罐的数量和尺寸可以降低，缩短整体的工艺时间线。由于在生长过程中会发生积聚的生长抑制性因子被连续去除，再结合通过调节细胞特异性灌流速率（CSPR）而优化补液策略，灌流可获得更高的生物质。此外，N-1灌流概念可实现生产生物反应器以更高的密度接种，从而缩短工艺运行时间或获得更高的终产物浓度。最近，已有多篇文章报导了关于CHO抗体工艺前期灌流的案例。
而且，这些研究确认，使用来自前期培养的、更高的生物质，实现生产规模的高接种细胞密度，可提高强化工艺中的单克隆抗体产量，降低工艺时间。
更重要的是，在最终生产生物反应器规模中，通过更快地从生长进入稳定生产期，结合优化的培养基，可提高空间-时间产量。据Yang等报导，这种概念，通常也称为浓缩补料分批或极高接种密度工艺（uHSD），集合培养基和种子开发策略，已经显著出了特别的潜力。Hiller等报导了结合灌流的混合策略以及细胞依赖型补液策略，将这种概念进一步向完全连续生产推进，同时仍适用于现有生产设施。培养基和补液优化的目标是补偿平台培养基在更高的细胞密度条件下的局限。
本研究结合了使用基于切向流过滤（TFF）细胞截留的前期灌流和生产培养的极高细胞密度接种，目标是维持产物质量、提高单位体积产量，从而从整体上强化用于单克隆抗体生产的CHO补料分批工艺。
在这个过程中，通过灌流培养的机制建模以及使用二代测序（NGS）的转录组图谱，获得了更深入的工艺了解，从而可进行系统性的分析以及促进对工艺强化策略的采用。
材料和方法
细胞系、培养基
细胞培养实验使用CHO-DG44源性细胞系进行，其表达全人源化、单克隆IgG1抗体，分子量约为150kDa。生长、生产和补液培养基源于研究使用的专利BI-HEK平台。针对灌流细胞培养和随后的最终阶段（N阶段）高接种密度设置，建立了改良的标准培养基。所有培养基成分和试剂要求为细胞培养或制药级。
种子培养
对于种子培养，细胞冻融并在摇瓶（Corning，US）中每3天传代，孵育箱设置为120rpm、36.5℃及5% CO2。对于中试规模灌流的种子培养，细胞传代8次并依次在摇瓶、波浪混合生物反应器（Sartorius，Germany）以及玻璃搅拌罐生物反应器（STBR）中以批次模式扩增。
灌流种子培养
来自种子培养的细胞用于接种N-1灌流培养。实验室规模灌流在4L玻璃搅拌罐生物反应器（Schmizo，Germany）中进行，工作体积3.1L，连接一根外置的中空纤维过滤器，以TFF模式进行细胞分离。规模放大至中试规模时，N-1灌流在20L 玻璃搅拌罐生物反应器中进行，工作体积16L，实验使用KML 100系统（Spectrum Laboratories Inc., Now Part of Repligen，US）。不管哪种规模，细胞通过Levironix磁悬浮离心泵泵动通过外置中空纤维过滤器，恒定灌流速率设置为0.4L/min，以使细胞在外部流路中的滞留时间<1min。灌流速率通过基于天平的反馈回路自动控制。使用孔径0.2或0.65μm的中空纤维，将细胞截留在生物反应器系统内，并漂洗掉副产物和产物。灌流培养持续时间为5-6天（直到获得足够接种uHSD培养的细胞量），包括起始批次阶段的额外1天。温度控制为37℃，并使用CO2鼓泡和1M碳酸钠溶液，将pH控制为6.8 – 7.2，工艺结束时，N-1灌流获得的细胞用于接种对照和浓缩补料分批生产培养。
补料分批生产培养
实验室规模补料分批生产培养在2L玻璃生物反应器上进行，而规模放大至中试规模在80L STBR（Applikon，Netherlands）上进行。浓缩补料分批工艺以高细胞密度（uHSD）10x10^6cells/mL接种，而对照工艺接种以0.7x10^6cells/mL接种。起始的批次阶段后，对照组增加营养物补液，而浓缩补料分批培养在接种后立即开始补液，直到工艺结束。不管哪种规模或接种细胞密度，培养持续时间为11天，温度、DO和pH控制为平台条件。如有必要，增加额外的葡萄糖补液，以维持培养中的最佳葡萄糖浓度。对于1个2L实验室规模uHSD运行，在测试的第6天，进行乳酸钠补液；在中试规模（80L）中，使用乳酸钠原液以使乳酸浓度维持足够高，利于乳酸消耗。
分析方法
生物反应器培养每天取样。使用CEDEX分析仪 MS20 C（Roche，Germany）确定细胞计数和活性。代谢参数不仅包括葡萄糖、乳酸、氨、谷氨酰胺和谷氨酸，还通过Konelab Prime 60i（Thermo Fisher Scientific，US）系统对免疫球蛋白G滴度浓度进行定量。pH、pO2和pCO2使用Rapidlab 348血气分析仪（Siemens，Germany）离线检测。渗透压使用OSMOMATauto（Gonotec，Germany）监测。进行产物质量分析时，收获的无细胞培养液使用1mL规模的protein A捕获步骤处理。随后，ACQUITYUPLC H-Class Bio（Waters，US）进行超高效体积排阻色谱（UPSEC）、使用iCE280（ProteinSimple，USA）进行成像毛细管电泳（iCE）、弱阳离子交换层析、毛细管凝胶电泳（cGE）以及使用Caliper GXII（Perkin Elmer，USA）进行寡核苷酸图谱分析。
转录组学图谱和建模
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结果和讨论
在4L 实验室规模和20L规模放大中进行的前期灌流
N-1阶段的灌流首先在4L实验室规模反应器内建立，工作体积3.1L（0.1L为流路内体积）。设置使用经改良的生长培养基，单位体积置换速率从0.4vvd逐步增加到2.3 vvd，在工艺结束时，总量约相当于置换7个反应器体积，这可直接转换至典型的商品化设施，其一般前期生物反应器体积与培养基储罐的体积比为1:7.5。图1所示为CHO DG44细胞系良好适应灌流工艺模型后的生长和代谢数据。模型考虑了大规模实施时的强制性约束条件，用于描述随时间变化的重要工艺参数，如生长和主要底物消耗速率，以评估工艺形式对灌流培养的影响。对于N-1灌流，在6天工艺时间内，达到峰细胞密度45x 10^6cells/mL。生长和底物浓度显示，在整个灌流过程中，可保证充足的供应条件，对上清液中氨基酸的检测也确认了这一点。灌流工艺的目标平均细胞特异性灌流速率（CSPR）为0.12 nL/cell/day。为了便于大规模实施，没有采用按指数增加的调节方式，而是采用了按每日调节的简化步进式方式，最终获得的范围为0.04– 0.19 nL/cell/day，以此前报导一致。此外，生长速率和代谢趋势随工艺时间降低，表明处于非完全的稳态，但多个重复确认了获得的生物质可用于uHSDN阶段的接种。
图1. N-1前期灌流培养。对于4L实验室规模运行和20L中试规模，检测以下参数：a)活细胞密度（VCD）和活性（Viab），b）代谢物葡萄糖（Glc）、上清液中乳酸（Lac），a）细胞特异性灌流速率（CSPR）和每日置换体积（vvd），d）上清液中谷氨酰胺（Gln）和氨（NH4+）。e中显示为生产速率。
为规模放大至中试规模，使用相同的培养基，且单位体积置换速率保持恒定。实验观察到稍高的生长速率。所以，在5天工艺时间后，即可达到>40x10^6cells/mL的密度。结果是，检测到了更低的CSPR，且在第5天出现葡萄糖限制，使细胞活性出现轻微下降。中试系统优化的性能可能与中试系统中优化的流路设计有关：TFF进样流路采用反应器底部出口，而在实验室规模中，采用从反应器顶部伸入导管。实验室和中试规模系统均采用磁悬浮离心泵，以保证低剪切应激。所以，在实验室规模系统中，从顶部导管抽液的方式导致了更高的离心泵泵速，继而形成更高的剪切力。不过，实验室规模系统中低于1100S-1的剪切力已经低于之前Lin等报导的数据。而在中试规模中，剪切力保持在更低的水平，约为400S-1，这可能与更优化的性能有关。
图2. 补料分批生产培养。上部：N阶段细胞培养数据，包括a）活细胞密度（VCD）、b）活性、c）产物浓度、d）代谢物乳酸、e）渗透压以及f）平均细胞特异性产率qp。下部：相同培养的产物质量数据，包括g）UP-SEC检测的完整性，h）电荷异构体，实验室规模使用ICE280，中试规模使用WCX，i）毛细管电泳、j）糖基化。
总结来说，前期灌流可有效地将生物质生产转移至前期阶段，并生产足够量的活性细胞，用于N阶段生产工艺的超高密度（uHSD）接种，10x10^6cells/mL。如Blaschczok等所指出的，离心泵可进一步规模放大，同时通过反应器底部端口进行连接，有利于降低剪切率。
浓缩补料分批生产培养
uHSD实验室规模工艺的第一次迭代，是相比对照工艺，确定培养基成分可提高从N-1到N阶段的可转移性和代谢特性。所以，对N阶段生产培养基中的代谢物乳酸和L-谷氨酰胺进行了调节，以模拟N-1阶段最后一天的浓度。目的不仅是为了提高可转移性，同时也是出于各种原因而避免本研究中过多的培养基开发工作，如监管接受度、需要新的基础粉末采购源或者需要鉴定新培养基的稳定性。尽管没有观察到对细胞培养性能的影响，转录组学分析显示，相比平台培养基使用的v0.1版本，在培养转移至uHSD运行时，遗传性异常降低，包括培养基适应。该结果可能的原因是低应激性环境。这为uHSD设置提供了适应的、非平台生产培养基，可作为后续工艺开发方法的基础。
图2所示为作为参考的补料分批对照工艺和在2L实验室规模系统和规模放大至80L中试的浓缩补料分批工艺的直接比较。收获和产物质量分析在工艺最后一天进行。结果明确显示，在使用uHSD概念的相当工艺运行时间内，mAb产物滴度可提高1.5倍。值得注意的是，相比对照工艺，实施乳酸补液策略可进一步将mAb产物滴度提高1.9倍，相比基础的uHSD方法，最终显著提升的活性结果也证实了这一点。按uHSD原理，滴度通过空间-时间-产量得以提升，不仅在于培养更快地从生长期进入稳定生产期，也在于增强的平均细胞特异性产率（平均qp，图2f）。对于基础uHSD运行，增加10%，而对于完全开发的版本，包括乳酸控制，相比对照组，平均qp增加了18%。之前已有报导，对哺乳动物培养工艺本身进行乳酸补液可提高特异性产率。这种效果可能在于高渗透压效应。在我们的研究中，相比采用低补液的对照运行，uHSD运行通常在培养后期，会形成稍高的渗透压，这可能是由于更高的补液速率所导致的。相反，额外的乳酸补加没有进一步增加渗透压，因其被细胞快速消耗（图2）。有趣的是，Becker等报导，由于葡萄糖限制，细胞特异性产率可增加50%。相似的，我们观察到在培养第1天，约1g/L的较低、但不受限的葡萄糖浓度，随后代谢转移至乳酸消耗。乳酸补液实际上提高了乳酸消耗速率，导致了更高的最终mAb滴度。总体来说，我们认为乳酸消耗阶段是浓缩补料分批工艺中细胞培养性能的一个优势。这些结果也符合Luo等报导的研究，其证实，从乳酸生产向乳酸消耗的代谢转移，可从产率和细胞生长角度，提高工艺性能。
工艺成功规模放大到了中试规模，获得了相当的最终mAb滴度，但也观察到了更高的峰VCD，这导致了细胞特异性产率的降低。在给定的2L小规模系统中，与规模相关的偏差可能是由于这种特定细胞系的特殊规模效应。由于更高的细胞密度，相比在玻璃生物反应器中的运行，需要更高的乳酸添加。
从产物质量属性考虑，对比对照补料分批工艺和uHSD工艺，mAb纯度和完整性不受影响（图2g-j）。N-链糖基为所用细胞系的典型结构，以A2FGO糖型为主。一种轻微的趋势显示，产物半乳糖化和平均qp之间存在负相关，原因可能是在更低的生产速率下，糖基结构达到成熟的时间跨度更长。总体来看，微小的差异可以忽略，结果可以认为是相当的。由于实验室和中试规模运行中使用了不同的方法，分别为ICE和WCX，所以中试规模中，电荷异构体分布的细微差异可能是一种分析结果。研究观察到的产物质量属性的稳健性与Yang等报导的结果相符，其报导产物质量属性的接种细胞密度依赖性存在与否，取决于使用的不同CHO生产克隆。不管怎样，特定的设置差异也可能扮演了一定的角色（优化方式如可以考虑使用ATF替代TFF，调节管路内滞留时间以及CSPR）。
使用乳酸补液的uHSD版本工艺总体潜力非常高，滴度可提高1.9倍，同时获得相当的产物质量，而不需要改变细胞系和工艺设置，可匹配现有的生产设施。对于使用常规补料分批工艺的、已经进入临床试验或已经获得上市许可的生物药，这些都是关键参数。在预期用途方面，开发的策略优于其它已知的强化策略，如完全连续的生产，后者虽然可能可获得更高的单位体积产量，但是，未能完美解决的特定技术或法规问题以及与现有项目的可比较性，完全连续生产几乎不可能在现有的补料分批设施中采用，或者至少极具挑战性。
表1. 超高密度接种概念对产能利用的影响
低接种参考补料分批（对照）的最终产物滴度与最佳性能uHSD运行比较，后者包括乳酸补液。计算每年生产批次数量，以评估uHSD概念的最大批次数降低程度。对于标准的补料分批工艺，每年进行147个批次，为计算批次产量，假定生物反应器周转时间为3天。
产能利用
报导的结果证实，前期灌流结合浓缩补料分批生产有潜力提高产能利用，因其可在N-1阶段更快地累积生物质，并在最终的生物反应器阶段（N阶段）获得更高的细胞特异性产量。根据参数的差异，如设施结构、滴度提升以及工艺时长，不同的操作策略会有不同。首先，生产生物反应器的运行时间可降低45%，至6天，而获得与为期11天的对照补料分批工艺相当的滴度。Yang等提出了一个经验性公式，用于估算每年可进行的最大生产批次数，其考虑了N-1种子培养的工艺时长、生产生物反应器的周转时间、生产运行的工艺时长、整个生产周期的时长、以及可用生产罐与种子罐的比例。考虑到最常见的商品化设施设计为总共6个大规模生产生物反应器以及4个种子扩增链，每年的批次数理论上可增加14%。但是，还有两个更重要的方面需要考虑：首先，需要考虑种子生物反应器的周转时间。其次，另需一个罐用于灌流培养基储存，其占地可能相当于另一个大规模生产生物反应器。此外，每年批次数其实更受限于收获和下游程序中的瓶颈，而不是≤11天的生产生物反应器。
所以，另一种策略是在与标准的、低接种补料分批培养相当的运行时间内，通过使产物浓度翻倍，而提高单个批次的输出量。在表1中，低接种对照补料分批工艺的最终产物浓度与性能最佳的uHSD运行相当，包括进行乳酸控制。若要在一年内生产相同量的产物，如批次产量从2.1提高到3.9kg/day，每年批次数可降低46%，从每年147个标准批次降低到79个强化批次。
综合以上各方面，研究结果表明，对于这种特殊的布局，提高工厂产能的最佳策略是降低每年的生产批次：即省去几乎一半的批次，而维持相同的产物产量。
为进一步提高批次产能，增强接种细胞密度，如20x 10^6cells/mL，以进行浓缩补料分批是值得考虑的途径。但是，对于这种方法，有几个限制需要拿捏：如可匹配现有设施的N-1灌流的有限运行时间，灌流过程中的最高培养基置换体积以及限制N阶段接种的分流比。在描述的设置中，10x10^6cells/ml代表了最高SCD，包括N-1性能的安全范围。然而，进一步优化N-1灌流工艺，可能可获得更高的SCD，以用于浓缩补料分批。
使用二代测序（NGS）的转录组图谱
请参考原文。
总结
总结来说，研究为N-1前期灌流以及使用或不使用超高接种密度的生产生物反应器中的CHO生产细胞培养的工艺性能、产物质量以及基因表达提供了深度分析。研究成功进行了基于TFF的前期灌流策略，通过将生物质生产从N阶段转移到前期生物反应器，并达到45x10^6cells/mL的密度，实现了种子扩增链的优化。该策略可以使用极高的接种密度接种生产阶段反应器，提高整体单位体积产量。结合工艺优化策略，如乳酸补液，uHSD培养在相当的运行时间内，使mAb产物滴度提高1.9倍，且对产物质量无较大影响。所以，从相当的产物质量、不受改变的细胞系及其适配现有生产设施看，该强化策略符合用于现有项目（如已经达到临床试验或已经获得上市许可）所需满足的所有强制要求。此外，该策略通过使单个批次产量翻倍，可将年生产批次数降低46%，从而增强设施利用率。工艺成功规模放大至中试规模进一步证实了高策略用于工业化应用的潜力。研究报导了通过前期灌流和极高接种密度，实现综合工艺强化的方案，研究同时结合了使用NGS的转录组学分析和工艺性能评估。使用NGS，鉴定N-1前期灌流中有稳定的基因表达模式，而在种子培养液从N-1转移至N阶段时，培养基适应降低了异常基因的数量。此外，相比对照补料分批工艺，在uHSD培养基中，发现更早地从生长相关基因表达模式向生产阶段相关基因表达模式转变。转录组学图谱数据显示，uHSD培养中加快的培养阶段进程以及更早的死亡阶段可能与E2F1的下调有关，其可能作为细胞周期进程、细胞增殖以及凋亡的主要调节因子。为确认该观察结果，有理由在CHO细胞中稳定过表达E2F1，以功能性验证E2F1在uHSD生产工艺中的调节角色。
原文：L.Stepper, F.A.Filser, S.Fischer, Pre-stage perfusion and ultra-high seeding cell density in CHO fed-batch culture: a case study for process intensification guided by systems biotechnology. Bioprocess and Biosystems Engineering, 2020, https://doi.org/10.1007/s00449-020-02337-1.
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