灌流细胞培养的控制策略

生物制药行业对连续生物工艺的兴趣在不断上升，因为行业内越来越多的成功案例经验证明了这种工艺方式的潜在价值。BioPlan协会2020年进行的一项调查显示，参与调查的200家公司中，有超过一半的的公司表示，他们将未来12个月内积极或非正式地评估连续上游技术。这点毫不奇怪，全球连续生物工艺市场估计将以23%的复合年增长率从2020年增加到2030年的3.1亿美元。

上游连续生物工艺的核心是灌流。这种工艺的好处之一是能够在稳态条件下操作更长的时间，从而获得更加一致且更高的产品质量。然而，稳态的维持需要有效的过程监测和控制。

Lonza高级研发主管Atul Mohindra表示，监管当局对可优化工艺控制和一致性的连续生物工艺的支持、鼓励和指导，是行业开发先进过程分析技术(PAT)并将新的解决方案引入灌流工艺的主要驱动力。”PAT工具在生物技术行业中越来越被接受，这些技术的采用正在促使之前无法进行的新的控制策略的成形，”Lonza首席研发科学家Thaddeus Webster补充说。因此，他认为，优化的过程控制、错误预防和理解正在一天天地变为现实。

需要克服的监测挑战

在对灌流工艺进行控制之前，必须对其进行有效的监测，但有价值的数据的实时采集并不总是一项简单的任务。Catalent Biologics工艺开发总监Claudia Berdugo-Davis说，主要的挑战包括精确监测细胞的密度、主要营养物质和代谢物以及使用典型的在线实时监测参数(如pH、温度和溶氧)来监测生长和代谢数据之间的关系。她说:“由于缺乏对灌流工艺中关键过程参数的了解，影响了开发有效控制策略的能力。”

在更为颗粒性的层面上看，需要对细胞密度进行在线监测，以达到细胞特异性灌流速率。此外，对补液、收获和废弃速率的控制也至关重要，而所有表征过滤工艺的参数(如进样流速和压力、滤液流速和压力)对设计一个稳健且可再现的过滤工艺同样关键。

Webster补充说，应该特别注意代谢物监测和活细胞体积。他解释说:“虽然可以对细胞体积进行每日调整，但这样做可能导致细胞培养需求的过度简化，因为培养的细胞代谢在动态环境中会发生变化。”每日测量代谢物水平和基于这些结果调整灌流速率也会导致类似的问题。

Mohindra认为，对产品质量的控制同样重要。“传统上，在补料分批生产过程中，产品属性在批次结束时测量，作为质量控制放行检测的一部分。然而，考虑到灌流工艺可以设计运行超过60天，因此，对于确保产品质量一致性的更多参数的监测至关重要。挑战在于如何确定并监测正确的参数，如何准确地做到这一点，以及如何确保及时的反馈循环，”他评论道。

在宏观层面上，对可变性的解释极大地影响了下游设备和控制策略的复杂性，对灌流工艺液流进行更高水平的监测和控制有助于减轻下游工艺设计的负担。

常见PAT工具

许多常用的传感器技术已经被用于灌流工艺的监测。根据Berdugo-Davis所说，除了完善的pH、温度和溶氧监测方法，用于监测细胞生长的生物质电容传感器以及用于理解生物质与一些关键代谢物之间关系的各种光谱工具也已经被开发出来。

Webster补充说，最近，使用电容探针的在线活细胞计数/活细胞体积(VCC/VCV)监测已经开始用于灌流速率/废弃速率的调节。他说:“这些PAT工具允许对灌流速率进行近乎连续的反馈，从而获得更加一致的灌流工艺。除了广泛使用基于电容的传感器来监测细胞密度以及通过重量来控制补液、收获和废弃流速外，可以使用一次性使用压力传感器进行跨膜压的评估。

Mohindra则表示，关键营养物质的检测也被用于监测和控制灌流过程。“从表面上看，在灌流培养中控制葡萄糖和某些氨基酸可以使一个给定的工艺在培养性能和产品质量方面得到更好的控制。”他说。

Webster还强调，在线分析和控制可将操作员从"方程式"中移除，因为不需要打破无菌屏障来获得样品以进行分析和控制。他断言:“从操作员的角度来看，这种方法降低了工艺的复杂性，同时，潜在地消除了对离线设备进行日常校准/维护的需求。”

监测技术发展

PAT工具在多个方面都取得了进展。其中一个重要的领域是将现有的传感器和控制策略从不锈钢领域转移到一次性使用操作领域，这是现代化灌流工艺的一个重要推动因素。

用于在线分析的光谱技术的发展则是另一方面。据Webster表示，如今，许多利用光谱学原理的PAT工具已经在生物工艺中使用，比如拉曼光谱已经被广泛用于补料分批工艺，可能很快会在灌流工艺中铺开。他说:“通过拉曼光谱测量多个工艺参数的能力，应该能够实现近乎连续的灌流和废弃速率调整，而目前每天调节的方式无法实现这一点。”他说。Berdugo-Davis则表示，行业目前正在进一步努力扩大可用技术范围，包括在线高压液相色谱、近红外光谱和质谱分析。她说:“这些工具可能有助于更好地理解细胞在动态环境中的功能特性，如灌流系统。”

据Webster说，PAT的发展已经帮助可以减少离线采样的需要。活细胞密度和代谢物分析的离线分析对于理解生物反应器的培养状态来说至关重要，但这需要熟练的操作人员无菌取样、校准设备、执行分析并上传结果。使用在线技术取代离线分析，可减少与离线分析相关的潜在误差，”他评论道。

对于不能通过在线探针进行准确检测或分析前需要预处理的参数(如产品质量属性)，Webster指出，已经开发了特定的近线分析方法，其利用自动采样系统的优势，可拉取所需样品，以进行分析。他解释说:“这些方法的目的是消除操作人员在工艺过程中进行人工干预的需要，同时还能收集有关工艺变化的信息。”

Berdugo-Davis说，另一个进步是数据分析技术的快速发展，其已能够处理现有PAT工具产生的大量数据。她说:“为了能够更快地理解多个工艺参数之间的关系，并应用这些知识来始终如一地实现最佳工艺性能，这样的进步是必要的。”

采样技术发展带来的帮助

在生物反应器的无菌操作中，采样总是一个风险。Berdugo-Davis说，工作的目标是开发用于高通量系统和小型生物反应器采样的自动化工具。“自动采样系统与PAT及控制回路整合，可以帮助阐释关键工艺参数，以进行更有效的控制策略的制定，”她说。

Mohindra认为，考虑到灌流工艺的持续时间，无菌采样技术的稳健性和可靠性对确保“批次”成功至关重要。这包括在与灌流工艺相结合的后续纯化步骤中必须进行的任何采用操作。

Webster指出，流体技术的发展对于新型采样技术的开发非常重要。例如，他指出，Lonza的MAST自动采样系统能够将高粘度样品送至最终分析目的地。他说:“这种能力可以对过去需要离线采样和分析的多个工艺参数进行近线采样和分析。”当与自动样品准备系统连接时，Webster补充说，可以消除操作人员对样品进行操作的需要，从而提高稳健性和分析通量。

仍需解决的问题

尽管迄今为止所有的进展都有助于加强灌流工艺的监测和控制，但仍有许多需要进一步改进的地方，比如能够足够精确地对影响产量、产率和/或质量的直接贡献者进行控制的”非专用”传感技术，而不需要针对每个细胞系和工艺进行特定的开发。

根据Berdugo-Davis的说法，大规模条件下的PAT解决方案仍需改进，特别是在面对高细胞密度、典型的生物反应器干扰以及长时间培养在线传感器稳定性方面。例如，Mohindra指出，在线pH传感器技术仍然容易发生漂移，因此仍可能需要操作员取样并进行离线测量。Mohindra认为，我们还需要更先进的技术来测量溶氧、pH值、温度、葡萄糖和氨基酸等传统参数，从而提供更多关于细胞内正在发生什么的信息，这将是该行业的一个重大变革。

不同供应商的产品之间的兼容性在工艺自动化方面仍然是一个挑战，Mohindra补充道。将所有灌流相关数据(如在线活细胞密度读数、流速和压力)与生物反应器及细胞培养性能的其它数据一起汇集到一个储存库中是另一个问题，仍有待开发和研究

原文：C. Challener, “Control Strategies for PerfusionCell Culture," BioPharm International, 33 (11) 2020.

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