神经细胞器作为特殊自噬性溶酶体在衰老和帕金森氏症中的重要作用
在衰老过程中，尤其在帕金森氏症（PD）中，神经细胞器内聚集了大量的神经黑色素（neuromelanin，NM）和脂质体。在研究含NM细胞器的过程中，蛋白质组学、脂类组学、成像技术及生化技术等的综合应用对全面理解大脑衰老和神经退化过程中的分子机制是必须的。之前的研究虽已部分明晰了这些问题。但未鉴定完整的通路，因此对于阐明在衰老和PD过程中神经元存活和易损性的调控是至关重要的。
2018年6月5日，来自意大利国家研究委员会生物医学技术研究所、意大利米兰大学及美国哥伦比亚大学医学中心等多家研究机构组成的合作团队的最新一项研究成果以Neuromelanin organelles are specialized autolysosomes that accumulate undegraded proteins and lipids in aging human brain and are likely involved in Parkinson’s disease为题发表在Nature子刊Parkinson’s Disease上【1】。
通过电镜对大脑区域神经元的研究表明，含有神经黑色素（neuromelanin，NM）的神经细胞器中具有丰富且清晰的“脂质体”（lipid bodies）和一个“黑色电子密度矩阵”（dark electron-dense matrix）（Fig.1）。在衰老过程中，此细胞器的数量和NM的浓度呈线性增加，且高度集中在黑质（substantia nigra）部位的多巴胺（DA）神经元上和蓝斑部位（locus coeruleus）的去甲肾上腺素神经元上，这此象在PD中尤为明显。NM实为一种由黑色素、脂肪族和蛋白质成分组成的化合物，且各成分的比例不定、NM含有大量金属。
Fig.1 Transmission electron microscopy images of NM-containing organelles in human SN tissue (a–c) and after the isolation procedure (d). a–c SN tissue of 89 y.o. healthy subject.
进一步的研究表明，在衰老过程中，由于细胞缓慢的周转率，导致这些细胞器不断累积。NM形成似乎是一个保护性过程，然而在PD神经元中NM的积累程度与神经元易损性密切相关。
由于其特定的生化特性，NM一直被认为是导致PD中神经易损的一个关键因素。事实上，由于受到细胞环境和条件的影响，NM具有毒性和保护性的双重作用。NM合成能从胞质移除具有活性/毒性的醌类（quinones，诱发神经毒性），因此NM的合成过程具有神经保护作用。
NM进一步通过螯和具有潜在毒性的金属（包括铁、锌、铜、铝、铬、钼、铅、汞、药物及有机毒物）。从黑质神经元释放出的NM或具有神经毒性，即NM释放大量金属和有机化合物，这些金属和有机化合物在PD中则会积累数年之久。同时在PD中退化神经元释放的NM则会激活小神经胶质细胞，产生致使神经元死亡和NM释放的活性/促炎性分子，从而形成神经炎症和神经退化的恶性循环。含NM的小神经胶质细胞的激活可以诱发黑质和蓝斑位点上的儿茶酸胺能神经元（catecholaminergic neurons）的抗原呈递（antigen presentation），这一反应可能在PD发病机制中起着至关重要的作用。此外NM会促进树突细胞的成熟。
不同类型NM中，黑色素组分的结构是不相同的。NM结构具有多特征性，含有NM细胞器中的蛋白质和脂质组分仍未被没有完全的鉴定。之前的研究中部分蛋白质成分已被鉴定出来了，且性质与溶酶体性质相一致。
尽管这些研究结果有助于对神经细胞器复杂性的认识，但这些蛋白质的特征和定位仍未被阐明。目前的研究数据并未表明在细胞器内的NM积累、蛋白质、脂质传输和积累的机制，也未表明这些细胞器在神经元内的作用。NM是在这些细胞器中合成的或者是在其他地方合成的更是未知。
在本文中，为了深度理解这些蛋白质和脂质的特性，研究者首先对含NM细胞器的样本进行高度纯化。同时为了控制污染、免蛋白质或脂类的流失，又制备了三种不同的含NM的样品（黑质样本、含NM色素的细胞器样本、NM色素样本）。为了获得有力数据，研究者并对样品进行了液相色谱-质谱（LC-MS）、免疫电子显微镜（IEM）、蛋白免疫印迹和薄层色谱（TLC）等分析，并获得了蛋白质表达图谱、脂质通路图谱、以及运输蛋白和相关酶的特征的数据。
论文中，研究者通过对比分析含NM细胞器内的蛋白质和脂质途径，发现含有NM细胞器具有典型的溶酶体的膜和可溶性蛋白质，但其他特征溶酶体蛋白或缺失或很少表达。溶酶体酶（包括肽酶、硫酸盐酶、酯酶）在正常含NM细胞器中大量存在，然而，来自人脑黑质细胞器内脂肪酶和糖基酶的表达水平较低，致使某些分子的降解途径受限。某些溶酶体膜蛋白定位不足导致溶酶体活性和融合能力的下降，其中包括能使溶酶体酸化的V型质子ATP酶（V-type proton ATPase）（Fig.2-3）。
Fig.2 Histogram of cellular distribution of the 293 representative proteins found in all analyzed samples shown as relative number of SpC vs.cellular compartments.
Fig.3 Area-proportional Euler diagram of the 293 representative proteins (detected by SpC ≥ 2 as average value in at least one of the three types of samples) identified in ORG, TIS-NM, or ORG-NM.
在含NM细胞器中，LAMP2为低水平表达且为少量分布，这表明（特殊伴侣介导自噬的）溶酶体不会形成含有NM的细胞器。与之相反的是，在许多色素细胞的双层膜上，蛋白MAP1LC3B和SQSTM1的发现，证明了含有NM的细胞器的宏观自噬性质（macroautophagic nature），这些细胞来自吞噬细胞，其能吞噬胞质中的NM前体、脂质、蛋白质（Fig.4）。
Fig.4 IEM of SN from healthy aged subjects for selected proteins. For number of IEM experiments
Fig.5 WB (for proteins detected by IEM in Fig.4) performed on SN tissue lysates and on ORG samples.
Fig.6 LC-MS analysis of lipids isolated from TIS-NM and ORG samples. The TIS-NM sample here represented was isolated from a pool of seven subjects (from 71 to 85 years of age), while the ORG sample was isolated from two pooled subjects (74 and 89 y.o.).
（含有NM的细胞器的）脂质体中，主要聚集组分是多萜醇（dolichols ）和多萜醇酸（dolichoic acids），两者很有可能是由SCARB2和APOD运输的。在含NM细胞器中，多萜醇的高度积累是通过与其他细胞器的膜融合、多萜醇酯的囊泡运输、多萜醇的水解作用来调控的（Fig. 4, 5, 6, 7）。
Fig.7 High performance TLC analysis of total lipid extracts obtained from TIS-NM and ORG samples
整个生命周期内，含NM细胞器内会不断积累未被降解的NM色素、多萜醇、脂质、蛋白质和金属。尽管有不同蛋白酶和其他降解酶的存在，但那些依赖于细胞器酸化的降解过程常或被抑制或无效，不过还是发现如α-晶状体蛋白B链（Alpha-crystallin B chain）、热休克蛋白HSP 90-α（heat shock protein HSP 90-alpha）、微管蛋白聚合-促蛋白（tubulin polymerization-promoting protein）、GPNMB、泛素（ubiquitins）等其他蛋白的存在。这些蛋白质与NM的合成过程中的宏观自噬（macroautophagy）和体积降解相一致（Fig. 2,4,5.Table 2）。
含有NM细胞器内在积累的诸多蛋白质中，值得注意的是HLA蛋白，它能增强含有NM神经元的脆弱性，原因在于HLA蛋白可以在细胞膜上表现出抗原性，从而使神经元成为T淋巴细胞的攻击目标。
研究者认为，随着聚合-β结构蛋白（aggregated and β-structured proteins）的聚集，NM合成便在胞质内开始，这类包括SNCA、GPNMB和其他蛋白，它们通过结合被氧化的多巴胺或是多巴胺衍生物来生成加合物（adducts）、加合物又进一步氧化和聚合形成NM色素组分。因此蛋白-黑色素复合体会“吸引”金属铁和其他金属，然后聚集在自噬体液泡内，最后被运输到溶酶体。在这过程中，蛋白-黑色素复合体会与多萜醇反应并形成最终的NM，然蛋白酶会使蛋白-黑色素复合体的蛋白链/肽链断裂（Fig. 4,5,6,8）。
Fig. 8 Hypothesized scheme summarizing NM-containing organelle formation in human SN.
综合结果暗示，在神经元生命周期中，含NM的神经细胞器的周转率非常缓慢，大量分子的最终细胞内结构的确定并未被其他系统所抑制。
Major References
【1】Fabio A. Zucca,et al.Neuromelanin organelles are specialized autolysosomes that accumulate undegraded proteins and lipids in aging human brain and are likely involved in Parkinson’s disease. npj Parkinson’s Disease.，4,（2018）
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