非小细胞肺癌外周血EGFR基因突变检测方法及应用实例
非小细胞肺癌（NSCLC）是肺癌中最常见的类型，对于有EGFR敏感突变的NSCLC，采用EGFR-TKIs治疗能取得明显的临床疗效。
T790M突变是最常见的EGFR-TKIs耐药机制，通过对外周血进行EGFR基因突变检测，可以筛选出EGFR-TKIs治疗有效或治疗过程中对其产生耐药的患者，其定量分析不仅在肿瘤的早期诊断中具有重要意义，而且是疗效评价及随访的重要生物学指标。
部分肿瘤细胞从原发肿瘤组织中脱落进入外周血、胸腔积液、唾液、粪便中，称为游离肿瘤细胞，游离肿瘤细胞发生凋亡或肿瘤细胞在原发肿瘤组织中凋亡坏死后均可释放DNA到外周血、胸腔积液、唾液、粪便等部位，这些DNA称为游离DNA（cfDNA）。
研究证实，释放入外周血的游离肿瘤细胞或游离DNA可一定程度反映肿瘤基因表型。
Karlovich等曾采用不同检测方法反复试验后指出组织突变亦存在假阴性的可能，其原因可归结为肿瘤异质性，这在检测耐药突变T790M时更为突出，也间接证明了血浆代替肿瘤组织做为检测EGFR突变样本的优越性。
检测方法
目前，用于检测外周血EGFR突变的方法有很多，但是都各有其优缺点，包括：
测序法；
实时荧光定量PCR（RT-PCR）；
扩增阻滞突变系统（ARMS）；
突变富集PCR（ME-PCR）；
变性高效液相色谱法（DHPLC）及数字PCR等。
测序法
测序法是目前检测基因突变最基础、应用最广、最直接的一种方法，不仅能检测已知突变，而且能发现新的突变，且费用不高，是目前公认的检测基因突变的金标准。
该方法的优势是可以获得完整基因序列，所以可以发现未知的突变；但灵敏度不高，仅能检测突变含量在25%-30%以上的样本，容易出现假阴性。
而NGS二代测序不仅仅可以检测突变，还可以检测基因插入或缺失、拷贝数变异以及基因重排，能同时检测多种基因异常，且解决了一代测序灵敏度不高的问题。
优点：金标准、可检测未知突变、效率高。
缺点：价格较高。
RT-PCR
RT-PCR于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，该技术实现了PCR从定性到定量的飞跃，与常规PCR相比，其特异性更强，自动化程度高，目前已得到广泛应用。该方法可以检测出含量为1%以上突变，不足之处是检测依赖于扩增效率，这在一定程度上限制了精确定量检测。
优点：定量、特异性强。
缺点：受扩增效率影响。
ARMS
1989年Newton等在PCR的基础上，建立了AMRS。针对不同的已知突变，设计适当的引物以检测出突变基因。ARMS法敏感性可达到1%；引入新型探针技术的SARMS和Cobas@敏感性可达0.1%。ARMS的不足之处在于只能检测已知突变。
优点：灵敏度高、检测通量高。
缺点：只能检测已知突变。
数字PCR
数字PCR的问世给基因分子检测带来了里程碑式的改变，其通过将样品大倍数稀释，使每个细分试样中所含有的待测分子数不超过1个，经PCR扩增后通过基因芯片逐个计数。这是一种绝对定量的方法，可以在大量野生型基因为背景时检测到含量极少的突变，无需校准。
近年来，在数字PCR基础之上又衍生出如微乳滴磁珠PCR（BEAMing）、微数字PCR（mdPCR）、微滴数字PCR（ddPCR）等敏感性和特异性更高、定量更精确、效率也更高的检测方法。ddPCR技术检测敏感性高达0.001%。
优点：灵敏度极高、精确定量。
缺点：只能检测已知突变。
表1 不同方法检测外周血样本中EGFR突变结果
表1列出了采用不同方法检测外周血样本中EGFR敏感突变结果。可以看出，ddPCR、NGS都表现了很高的敏感性。
在EGFR-TKIs治疗过程中，所有患者最终均会对EGFR-TKIs产生耐药，其中T790M突变为最常见的耐药机制，约占所有耐药机制的60%左右。
已有文献报道，T790M突变在外周血中的出现要早于影像学进展，最早可在影像学进展前16周在外周血中检测到T790M突变的存在。及时对患者的T790M突变状态进行动态监测便于医生做出更好的医疗决策，而用组织做T790M动态监测在真实世界里受很大限制，并且肿瘤组织有很强的异质性，而以外周血为标本检测T790M突变相较肿瘤组织则具备了很多优势。
随着外周血基因检测技术的持续进步，其未来的应用范围将会更多更广。
应用实例
血浆中EGFR总拷贝数及突变的EGFR拷贝数诊断肿瘤异质性及评估预后
研究招募了36位携带EGFR突变的非小细胞肺癌患者，并收集EGFR-TKI治疗前后的血液样本，采用ddPCR技术对血浆中EGFR突变情况进行分析（包括EGFR19Del、EGFR21 L858R、T790M突变及野生型EGFR）。
入组患者统计学分析及临床特征
入组36位患者，其中29位为晚期，平均年龄在63岁，69%的女性，55%不吸烟者， 24位患者接受EGFR-TKI治疗；7位为早期，平均年龄为64岁，43%的女性，43%不吸烟者。
非小细胞肺癌患者体内总EGFR拷贝数分析
分析比较了晚期患者与早期患者血浆cfDNA中EGFR拷贝数，结果发现，早期患者血浆中EGFR拷贝数要显著低于晚期患者，不携带EGFR突变的晚期癌患者血浆EGFR拷贝数也比早期的要高。在这些患者中，总EGFR拷贝数与肿瘤负荷无相关性。
图1 晚期非小细胞肺癌患者与早期患者血浆cfDNA中EGFR拷贝数比较
血浆EGFR突变定量分析
检测发现65%（15/23）晚期非小细胞肺癌患者存在EGFR突变，EGFR突变拷贝数/EGFR野生拷贝数比值从0.001到1.44。EGFR21 L858R突变血浆与组织检测结果一致性较高，达到83%（5/6）。EGFR19Del突变一致性达到62%。
图2 EGFR19Del与EGFR21 L858R突变患者血浆cfDNA定量分析
随后又评估了血液检测分析在肿瘤异质性上的作用：
在12%患者血浆中检测到EGFR21 L858R突变，而在肿瘤组织中却表现为阴性。同样的情况也出现在EGFR19Del突变检测中，有31%的患者在血浆检测阳性，而肿瘤组织中阴性。
T790M突变在肿瘤组织中都未能检测出，但是血浆检测中发现有13%的患者存在此突变，突变拷贝数/野生型拷贝数范围从0.003到0.1不等。
血浆cfDNA同样检测到17%的患者存在EGFR双突变情况，而肿瘤组织中未能检出，两位患者组织活检中分别存在L858R与19Del突变，但在血浆cfDNA中同时检出存在T790M突变。另两位患者组织中检测到19Del突变，但血浆中同时检出存在L858R突变。
7位早期患者血浆中未能检测出任何EGFR突变。
血浆EGFR突变定量分析的预后评估价值
图3 a.晚期患者中不同血浆EGFR突变值OS对比
b.晚期患者中不同血浆EGFR突变值PFS对比
c.晚期患者中不同血浆总EGFR拷贝数OS对比
d.晚期患者中不同血浆总EGFR拷贝数PFS对比
将晚期患者血浆中所含EGFR突变平均值94拷贝/ml作为临界值，低于此临界值的患者有着较长的OS值，而高于此临界值的OS值较短；同样的结果体现在PFS上。
有意思的是，总EGFR拷贝数低于平均值的患者相比高于平均值的患者有着更长的OS值；在PFS中也存在类似的结果，低于均值的患者平均PFS为783天，高于均值的患者为238天。
晚期患者随访过程中血浆EGFR突变情况
晚期患者接受EGFR-TKI治疗随访过程中也同时连续进行了EGFR突变的定量分析（图4）。
结果发现，随访过程中，血浆中EGFR突变的总量随着治疗过程的进行而减少，从基准线的65%，最好反应的31%，随疾病进展后又升至42%；19Del突变拷贝数同样减少，野生型的也减少，但均未达到统计学意义。相反，T790M随着治疗过程的进行，由原来的13%上升到疾病进展后的42%。
图4 晚期患者治疗过程中血浆EGFR突变动态变化
研究结果表明，非小细胞肺癌患者血浆中EGFR含量及突变量分析是一种较好的判断肿瘤分子特征及预后评判的工具，治疗前EGFR总拷贝数及突变的EGFR拷贝数具有指示临床预后的作用。
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参考文献
1.Zhang Y, Xu Y, Wang M. Research Advancement on EGFR Mutation Detection of Cell-free DNA and Tumor Cell in Peripheral Blood of Patients with Non-small Cell Lung Cancer. CJLC. 2016 Nov 20; 19(11):766-772
2.Alegre E, Fusco J P, Restituto P, et al. Total and mutated EGFR quantification in cell-free DNA from non-small cell lung cancer patients detects tumor heterogeneity and presents prognostic value. Tumour Biology the Journal of the International Society for Oncodevelopmental Biology & Medicine, 2016:1-8.
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