Cell：植物抗病研究新发现！

文章题目

A Pathogen-Responsive Gene Cluster for Highly Modified Fatty Acids in Tomato

发表期刊

Cell

（IF=38.637）

发表时间：2020

简介

    镰叶芹醇是一种典型的乙炔类脂质，存在于胡萝卜、番茄和芹菜中，可以抑制真菌和人类癌细胞的生长。本文结合非靶向代谢组学和RNA测序技术在番茄(Solanum lycopersicum)中发现了一个镰叶芹醇生产所需要的生物合成基因簇。通过重组外源宿主的初始生物合成步骤，并在番茄中生成转基因突变体，证明了该基因簇在番茄叶片中对镰叶芹醇的生物合成以及预防真菌、细菌病原体侵染的重要作用。

研究结果

1. 番茄通过表达一系列不同的生物合成基因和代谢产物来响应生物胁迫

    为了发现番茄中用于镰叶芹醇生物合成的候选基因，我们观察到利用生物诱导因子可以增加番茄植株中镰叶芹醇的含量。由于代谢物水平上的变化可能与生物合成酶的转录水平有关，我们对受到不同微生物胁迫的番茄叶片组织分别进行了非靶向代谢组学检测和RNA测序，根据非靶向代谢组学和RNA测序技术对样品进行分析的结果显示，受到不同植物微生物胁迫后机体会有不同的防御反应，这使我们获得了多种的基因表达变化，这些基因通常有助于防御，也有助于镰叶芹醇的生物合成。使用液相色谱-质谱(LC-MS)分析发现镰叶芹醇代谢物水平的显著变化(图1)，这表明通过对镰叶芹醇的代谢物和转录的相关分析，可以帮助我们对基因进行筛选，为阐明该生物合成途径的遗传基础提供了一个起点。图1 用LC-MS分析定量代谢组学分析2. 对镰叶芹醇生物合成途径进行假设    基于先前的植物脂肪酸代谢途径的例子，对乙酰化酶进行了分析，我们提出了一个关于哚酚生物合成的假设，它涉及到去饱和酶的多个步骤(所提出的途径见图2)。我们提出该途径的早期步骤可能涉及通过类似crep1的乙酰化酶将亚油酸转化为还阳参油酸。Crep1是已知参与修饰脂肪酸生物合成的少数酶之一；因此，我们推测番茄中可能需要一个相关的乙酰化酶将脂肪酸从初级代谢途径转化到次级代谢途径中。鉴于乙酰酶与其他去饱和酶的区别只在于少数氨基酸的变化，我们在番茄中并未找到与Crep1同源的菌株，我们通过搜索去饱和酶的方法来生成候选乙炔酶的列表。图2 镰叶芹醇的生物合成途径和候选酶类，虚线箭头表示已提出的反应，固体箭头表示以前植物所具有的转变特征3. 代谢与转录组关联分析揭示了修饰脂肪酸中去饱和酶的候选基因簇    在亨氏番茄基因组中预测的59个去饱和酶中，我们基于拟南芥蛋白质组结合BLAST和Pfam注释，在我们的RNA测序(RNA-seq)数据集中检测到了40个相应的转录本(图3A)。我们将这些转录本的表达水平与我们基于LC-MS对镰叶芹醇含量的检测进行了关联分析(图4A和4B)，分析发现6个基因表达水平与镰叶芹醇的含量相关性最强(图3B)，其中，有4个基因顺序位于第12号染色体上相同的区域(图4C)和高度共同表达。    其中三个基因被注释为去饱和酶，第四个基因被注释为去羰基化酶，这表明该位点编码了一组与脂肪酸代谢相关的酶。这些测序数据证实了一个由四个基因组成的基因簇的存在(图4C和图3A)，包括单独的Solyc12g100240和Solyc12g100260的全长序列。使用Solyc12g100240和Solyc12g100260的引物对PCR产物进行一代测序，区分两个基因序列，并将它们明确定位在基因簇中(图3A)。总的来说，我们的分析表明，该基因簇编码了三个推测的去饱和酶和一个推测的去羰基化酶。图3 番茄品种VF36中Solyc12g100240和Solyc12g100260的新基因组序列与图4相关图4 与镰叶芹醇生产有关的生物合成基因的发现4. 基因簇功能研究    为了探究Solyc12g100240和Solyc12g100260是否具有乙酰化酶的活性，我们利用农杆菌介导的瞬时表达技术在本氏烟草中过表达了240/260 cDNA。采用LC-MS法对皂化甲醇提取物进行分析，研究了皂化甲醇提取物的积累规律。在表达240/260cDNA的薄荷脑组织中，只检测到酸质子加合物的m/z值(图5; 图3B)。以ACET1a基因表达为诱饵对番茄叶提取物诱导后检测到的所有代谢产物进行反向相关分析，这些数据表明，Solyc12g100240和Solyc12g100260(分别改名为ACETYLENASE1或 ACET1；ACET1a和ACET1b)编码一种相同的乙酰化酶，将亚油酸转化为氯丙烯酸，表明它催化了番茄镰叶芹醇途径的第一步。该分析突出了基因表达与代谢产物的相关性，证实了ACET1a和ACET1b在镰叶芹醇生物合成中的作用。图5 番茄生物合成基因在烟草中的重组5. 候选基因的生化分析证明其在高修饰脂肪酸生产中的作用    进一步的基因簇检测表明，除了ACET1a和ACET1b外，Solyc12g100250和Solyc12g100270可能参与了镰叶芹醇的生物合成。它们注释的酶活性与提出的生物合成途径一致，并且Solyc12g100250和Solyc12g100270的表达水平与ACET1a和ACET1b的表达水平相关性最好。为了测试这些基因在镰叶芹醇生物合成中的作用，我们利用农杆菌介导的本氏烟草的瞬时表达，将每个基因与240/260 cDNA瞬时共表达，鉴定潜在的修饰脂肪酸代谢物。尽管我们无法使用可靠的标准品确认图5中所示的化学结构，但使用上述化学方法对炔烃进行MS/MS分析和衍生化，则表明它们是含有炔基功能的修饰脂肪酸。这些数据表明Solyc12g100250编码的去饱和酶可以使用戊烯酸作为底物。Solyc12g100270是拟南芥中的一种脂肪酸脱羰酶是CER1的五个番茄同源物之一，值得注意的是CER1/CER3对为单链修饰植物脂质的生物合成路线提供了支持。考虑到Solyc12g100270与CER1同源，我们推测该酶可能将镰叶芹醇前体的羧酸转化为烷烃末端，这是该修饰脂肪酸的特征。然而，添加或不添加Solyc12g100250、240/260cDNA和拟南芥CER3瞬时表达Solyc12g100270并不能产生新的代谢物。可能是Solyc12g100270在N中没有以活性形式表达，或者在该途径的下游发挥作用。6. 在番茄宿主中CRISPR/Cas9诱导的突变表明该基因簇是镰叶芹醇生物合成所必需的    作为研究Solyc12g100270作用的替代方法，我们直接测试了镰叶芹醇是否需要该基因。    此外，我们将ACET1a和ACET1b定位于验证途径的第一步。多个基因突变体（指定为DACET1和D270）在番茄中产生VF36背景（图6A；图7）。我们可以生成同时具有ACET1a和ACET1b基因座的突变株。(变异并将其称为DACET1（图7B）。在番茄VF36背景中产生了多个基因敲除突变体（命名为DACET1和D270）。通过非靶向代谢组学的分析，证实了拟南芥中ACET1的生化活性，表明ACET1a、ACET1b和Solyc12g100270是番茄镰叶芹醇生产所必需的物质。    综上所述，我们对DACET1和D270突变体的分析为这些基因参与镰叶芹醇合成提供了直接的证据。受这些结果的鼓舞，以及这些突变株系在以下病原菌分析中的应用，我们随后生成了Solyc12g100250突变的番茄株系，进一步探索这个不同寻常的去饱和酶在植物中的功能。我们还用了另一种菌株A.tumefaciens菌株C58C1进行诱导试验，该菌株诱导野生型叶片产生了更多的镰叶芹醇。在这种高诱导条件下，我们发现C58C1诱导的D250叶片中镰叶芹醇的产量比同样诱导的野生型叶片平均减少了88%(图6D)。这些研究表明，Solyc12g100250在微生物诱导后的镰叶芹醇合成中具有直接作用。观察到在D250突变体中仍然产生低水平的镰叶芹醇，这表明在番茄基因组中存在另一种具有类似活性的酶。总的来说，我们对DACET1和D270突变体的分析，结合D250的代谢物图谱，进一步支持了这组去饱和酶在修饰脂肪酸生物合成中的协调作用。图6 CRISPR / Cas9诱导的番茄定向诱变和基因互补图7 ACET1a/b、Soly12100270和Soly12100250的变体生成和代谢产物分析7. 番茄基因簇突变体在微生物感染过程中表现出抗性改变    为了评估基因簇对番茄免疫反应的贡献，我们测量了番茄毒性病原菌(一株真菌和两株细菌)在野生型和突变型叶片中感染和复制的能力。首先，我们检测了镰叶芹醇产量不足的突变株DACET1和D270他们对坏死性真菌灰霉病菌B05.10的抗性,发现镰叶芹醇抑制灰霉病菌的生长。将灰斑芽孢菌孢子施于番茄叶片表面，3 d后通过测定病变大小和真菌生物量来评价侵染情况。出乎意料的是，与WT叶片相比，DACET1和D270突变体叶片的病变大小和真菌生物量明显减少(图6A-6C、7A和7B)。这些结果表明，这些突变体中与镰叶芹醇生产相关的修饰脂肪酸的生物合成，导致了对灰霉病抗性的增强。图8 染病番茄WT、DACET1、D270和D250叶片的表型

结论

    该研究发现一个高度修饰脂肪酸的基因簇，证明了参与代谢的新基因簇中编码的三种去饱和酶的相互作用，它们协调作用于镰叶芹醇的生物合成，并可以提高植物的抗病性。

参考文献

Jeon J E , Kim J G , Fischer C R , et al. A Pathogen-Responsive Gene Cluster for Highly Modified Fatty Acids in Tomato[J]. Cell, 2020, 180(1):176-187.e19.

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