【生物选修1】2.2 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数

(1)土壤取样：

①土壤取样原因：土壤有“微生物的天然培养基”之称。同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。

②要求：富含有机质(富含有机质的土壤层中微生物数量大、种类多)，酸碱度接近中性且潮湿(土壤中的微生物大约有

70%~80%是细菌，此环境适宜细菌的生长)的土壤。

③取样部位：先铲去表层土3cm左右，再取距地表3~8cm的土壤层，将样品装入事先准备好的信封中。(取样用的小铁 铲和盛土样的信封都要经过灭菌)

(2)制备培养基：以牛肉膏蛋白胨培养基作为对照组，以尿素为唯一氮源的培养基作为实验组，用来判断选择培养基是

否具有选择的作用。

(3)样品的稀释与涂布平板：

①取样稀释：在火焰旁称取土壤10g，放入盛有90mL无菌水的三角瓶中，振荡使土样与水充分混合。将细菌分散，制成101倍土样稀释液。用1 支1mL无菌吸管从中吸取1mL土壤悬液注入盛有9mL无菌水的试管中，吹吸三次，充分混匀，制成102倍土壤稀释液。依次类推，制成103、104、105、106、107倍土壤稀释液。(稀释原因：样品的稀释程度直

接影响平板上生长的菌落数目)

②取样涂布：按照由107～103稀释度的顺序分别吸取0.1mL进行平板涂布操作。按照浓度从107~103的顺序涂布平板， 不必更换移液管(涂布时稀释倍数的选择：选用一定稀释范围的样品液进行培养，保证获得菌落数在30~300之间，便于

计数；如测定土壤中细菌的数量时，一般选用104、105、106倍的稀释液进行平板涂布培养；测定土壤中放线菌的数量

时，一般选用103、104、105倍的稀释液进行平板涂布培养；测定土壤中真菌的数量时，一般选用102、103、104倍的稀 释液进行平板涂布培养)。如下图：

 备注：

★图中1、2、3平板是选择培养基，4平板为牛肉膏蛋白胨培养基，以判断选择培养基是否具有筛选作用；要有两个空 白对照，即不涂布稀释后菌液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基，以验证培养基中是否含有杂菌。

★由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围103～107倍的稀释液。

★实验时要对所用的平板、试管作好标记。如培养皿要注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。

(4)微生物的培养与观察：

①培养：将涂布好的培养皿放在适宜温度(细菌一般在30～37℃的温度下培养1～2d，放线菌一般在25～28℃的温度下 培养5～7d，霉菌一般在25～28℃的温度下培养3～4d)下倒置培养。随着培养时间的延长，会有不同的菌落产生。比

较牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录。

②计数：当菌落数目稳定时，选取菌落数在30～300的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对3个平板进行计数，然 后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。

③观察：微生物的菌落特征包括菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等方面。仔细观察分离到的菌落、最好以表格的形式将不同菌落的特征记录下来。