【生物选修1】5.2 多聚酶链式反应扩增DNA片段（PCR）

更多视频请参考：（直接点击下列链接查看）

一、 基础知识

（一）PCR原理

1、DNA复制

（1）条件：

参与的组分	在DNA复制中的作用
解旋酶	打开DNA双链
DNA母链	提供DNA复制的模板
____________	合成子链的原料
DNA聚合酶	催化合成DNA子链
引物	使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸

（2）3′端和5′端： DNA的两条链是反向平行的，通常将DNA的羟基末端称为3′端，而磷酸基团的末端称为5′端。

（3）DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA，因此，DNA复制需要引物。DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。

【注意】引物是DNA或RNA，用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸。

2、解旋：在DNA的复制过程中，双链的解开是DNA复制的前提。在体外可通过控制温度来实现。

3、PCR

（1）概念：PCR的全称为多聚酶链式反应，是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。[来源:学#科#网Z#X#X#K]

（2）DNA的热变性原理：在80～100℃的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性；当温度缓慢下降后，两条被分离的DNA链又会重新结合成双链，这个过程称为复性。

（3）原理：DNA的复制原理。

（4）PCR反应条件：①缓冲溶液。②DNA模板。③分别与模板DNA两条模板链相结合的两种引物。④四种脱氧核苷酸。⑤耐热的DNA聚合酶（一般用Taq DNA聚合酶）。⑥能够自动调控温度的仪器：PCR仪。

（5）PCR的反应过程:PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为变性、复性和延伸三步。

变性：当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链。

复性：当温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。

延伸：当温度上升到72℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在DNA聚合酶酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。

（6）PCR的反应结果：从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸，这样，DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列成2ⁿ扩增。

二、设计实验

（一）制备固定化酵母细胞

1、酵母细胞的活化：由休眠状态重新恢复为正常的生活状态。

2、配制物质的量浓度为0.05mol/L的CaCl₂溶液。

3、配制海藻酸钠溶液：海藻酸钠在水中溶解的速度较慢，需要通过加热促使其溶解。加热时最好采用小火间断加热的方法。如果加热太快，海藻酸钠会发生焦糊。

4、海藻酸钠溶液与酵母细胞混合：将海藻酸钠溶液冷却至室温，加入已活化的海藻酸钠溶液，进行充分搅拌，使其混合均匀，搅拌后吸入到注射器中。

5、固定化酵母细胞：将注射器中的混合液滴加到CaCl₂溶液中，形成凝胶珠状颗粒，在CaCl₂溶液中浸泡30min左右。

（二）、用固定化酵母发酵

1、将固定好的酵母细胞（凝胶珠）用蒸馏水冲洗2～3次。

2、将10%葡萄糖溶液转移至锥形瓶中，加入固定好的酵母细胞，置于25 ℃下发酵24h。

（三）结果分析与评价

1、观察凝胶珠的颜色和形状

如果制作的凝胶珠颜色过浅、呈白色，说明海藻酸钠浓度浓度偏低，该种凝胶珠包埋的酵母细胞数目较少，影响实验效果；如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，则说明海藻酸钠浓度偏高，制作失败，需要再作尝试。

2、观察发酵的葡萄糖溶液：利用固定的酵母细胞发酵产生酒精，可以看到产生了很多气泡，同时会闻到酒味。[来源:学科网]

（四）、课题延伸：工业生产中，细胞的固定化技术是在严格无菌的条件下进行的。

（五）、归纳：

1、加热使海藻酸钠溶化是操作中最重要的一步。海藻酸钠的浓度涉及固定化细胞的质量：如果海藻酸钠浓度过高，将很难形成凝胶珠；如果浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的酵母细胞的数目少影响实验效果。

2、观察凝胶珠的颜色和形状：如果制作的凝胶珠颜色过浅，呈白色，说明海藻酸钠的浓度偏低，固定的酵母细胞数目较少；如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，则说明海藻酸钠的浓度偏高，制作失败。

三、操作提示

1、为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的 微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌。

2、PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。

3、在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。

所有的成分都加入后，盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击离心管的侧壁，使反应液混合均匀。

4、混匀后离心处理，使反应液集中在离心管底部。