【生物选修3】1.2 基因工程的基本操作程序

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要点梳理

■第一步：目的基因的获取

1.目的基因是指：编码蛋白质的结构基因或是具有调控作用的因子。

2.目的基因可以从自然界已有物种中分离，也可以人工合成。人工合成目的基因的常用方法有反转录法和化学合成法。

3.基因文库包括基因组文库和部分基因文库（如cDNA文库）。二者的区别：

文库类型	文库大小	基因中是否有启动子	基因中是否有内含子	基因多少	物种间基因交流
cDNA文库	小	无	无	某种生物的部分基因	可以
基因组文库	大	有	有	某种生物的全部基因	部分基因可以

4.人工合成目的基因的两个条件：基因比较小；核苷酸序列已知。

4.PCR技术扩增目的基因

（1）PCR是多聚酶链式反应的缩写，原理DNA双链复制

（2）过程：第一步变性：加热至90～95℃，DNA解链，不需要解旋酶；第二步复性：冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链。变性和复性利用了DNA的热变性原理；第三步延伸：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶（Taq酶）从引物端起始互补链的合成。

■第二步：基因表达载体的构建（核心）

1.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。

2.组成：目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因

（1）启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。

（2）终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段 ，位于基因的尾端。

（3）标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素抗性基因。

■第三步：将目的基因导入受体细胞

（1）转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。

（2）常用的转化方法：

将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是 农杆菌转化法，其次还有 基因枪法和花粉管通道法等。将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是显微注射技术，此方法的受体细胞多是 受精卵。将目的基因导入微生物细胞：原核生物作为受体细胞的原因是 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少 ，最常用的原核细胞是大肠杆菌，其转化方法是：先用Ca²⁺处理细胞，使其成为感受态细胞，再将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。重组细胞导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达。

■第四步：目的基因的检测和表达

（1）首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子杂交技术。

（2）其次还要检测目的基因是否转录出了mRNA，方法是采用分子杂交技术。

（3）最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原－抗体杂交。

（4）有时还需进行个体生物学水平的鉴定。如 转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。

例.某重点实验室课题研究组欲将一株野生杂草的抗病基因转给一双子叶农作物．该农作物含有高茎基因，植株过高容易倒伏，科学家欲通过基因工程操作抑制高茎基因的表达．基于上述目的科学家进行了基因工程的相关操作，结合所学知识分析下列问题：
（1）课题研究组已经获得了抗性基因，欲体外大量扩增该目的基因需采用___技术，该技术的基本反应过程：目的基因受热变性后解链为单链，___与单链相应互补序列结合，然后在___的作用下进行延伸．
（2）基因工程操作的核心是___，该过程用到的工具酶有___．本研究中，欲将目的基因转入受体细胞，常采用__ _法．

答案：（1）PCR      引物    Taq酶（热稳定性DNA聚合酶）  
（2）基因表达载体的构建   DNA连接酶和限制酶      农杆菌转化

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