万字长文综述靶向蛋白降解（TPD）：PROTAC、LYTAC、分子胶、光控PROTAC...
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前 言
近年来靶向蛋白降解（TPD）技术得到了快速发展，特别是蛋白水解靶向嵌合体(PROTACs)。迄今为止，针对70多个疾病靶标，已经发现了大量降解剂。特别是，针对雌激素受体和雄激素受体的降解物已经进入Ⅲ期临床（ARV-471）。TPD技术极大程度上扩大了药物靶点的选择范围，并为解决传统小分子抑制剂无法解决的棘手问题提供了强有力的解决方案。本文就小分子降解剂的结构和生物活性以及新兴TPD技术的作用机制进行了综述。同时也阐述了目前在TPD领域中存在的挑战。重点描述了所报道的E3配体，并总结了靶向疾病相关蛋白的PROTACs研究进展，PROTACs的结构衍化及其生物活性。此外，其他新兴的靶向蛋白降解（TPD）技术，包括溶酶体靶向嵌合体（LYTAC）、基于抗体的PROTAC（AbTAC）、自噬靶向嵌合体（AUTAC）、自噬体栓系化合物（ATTEC）、分子胶、光控PROTAC和疏水标记小分子，也被引入作为化学调节细胞内蛋白稳态的重要补充。
靶向蛋白降解机制
背景介绍
图1 UPS介导的蛋白质降解
近年来，UPS诱导蛋白质降解取得了巨大进展，特别是Crews团队2001年提出的蛋白质水解靶向嵌合体（PROTAC）技术。在此项研究中，卵假散囊菌素与磷酸肽IκBα连接，IκBα可以识别并与E3连接酶复合物SCFβ-TRCP相互作用，从而获得PROTAC1（图2）。卵假散囊菌素是一种抗蛋氨酸氨基肽酶-2（MetAP-2）的共价抑制剂，能够催化从新生肽中去除N端蛋氨酸。因此，将预孵育的混合物1和MetAP-2混合物添加到未受精的非洲爪蟾卵的提取物中时，发现PROTAC1以剂量依赖性的方式降解MetAP-2。
图2 首次报道的PROTAC结构
PROTAC是一种双功能分子，包含两个“弹头”，由连接子连接，一个弹头与目标蛋白（POI）结合，另一个与E3连接酶结合。在三元配合物（POI：PROTAC：E3）形成后，POI被多泛素化并被蛋白酶体降解。PROTAC可以循环使用，并持续催化另一个降解过程（如图3）。三元配合物的形成是发挥PROTAC作用的关键步骤。
图3 PROTAC的作用方式
PROTAC的作用方式明显不同于小分子抑制剂，小分子只占据POI的活性位点，而不是加速其降解。因此，与小分子抑制剂相比，PROTAC表现出了许多优势：(1)PROTAC以事件驱动而不是占用驱动的方式发挥作用，因此PROTAC在催化量下足以产生良好的药理效果。相比之下，小分子抑制剂总是需要高细胞浓度才能有效地占据POI的活性位点，往往导致剂量依赖性毒性。(2)许多蛋白质，如转录因子、支架蛋白和非酶蛋白，很难被传统的小分子抑制剂来解决，因此它们被定义为“不可成药靶点”。(3)小分子抑制剂通常只破坏POI的一个结构域，而使其他疾病相关结构域的活性保持完整，而PROTAC通过降解整个POI来破坏所有结构域的功能。(4)PROTAC克服获得性耐药性这一棘手的问题，并有规避或推迟耐药性发生的潜力。(5)PROTAC可以实现较高的靶点特异性，而小分子抑制剂要区分与POI密切相关的亚型则具有挑战性。PROTAC日益成为医学研究领域的焦点，超过70种蛋白质被PROTACs靶向降解。
02
PROTAC配体研究进展
（1）CRBN配体：沙利度胺（图4）由Chemie Grünenthal公司开发，于1954年作为孕期的止吐药上市。然而，沙利度胺由于其严重的致畸作用被撤市，直到其免疫调节和抗炎作用被披露后才被继续使用。最初认为沙利度胺的S（−）对映体具有致畸作用，而R（+）对映体具有镇静作用。当分离出这两种对映体后，发现它们在生理条件下迅速相互转化。此外，最近证实了R和S对映体在新西兰兔模型中均具有致畸作用。因此，沙利度胺仍然以外消旋体进行使用。
图4 IMiDs的化学结构
沙利度胺及其类似物也被称为免疫调节药物（IMiDs，图4），现在用于治疗血液肿瘤：包括最初诊断的多发性骨髓瘤（沙利度胺）、难治性多发性骨髓瘤（来那度胺和波马利度胺）和5q缺失相关的骨髓增生异常综合征。长期以来，这些IMiDs的确切靶点一直不清楚，直到2010年证明沙利度胺靶向E3连接酶，即cereblon（CRBN）。从那时起，IMiDs分子机制的神秘面纱逐渐被揭开。CRBN是E3连接酶复合物CUL4-RBX1-DDB1-CRBN（CRL4CRBN）的一个组成部分，可作为底物受体。随后的研究表明，来那度胺加速IKZF1、IKZF3、酪蛋白激酶1 α（CK1α）和ZPF91的降解。Thoma团队揭示了硫胺：DDB1：CRBN的共晶结构，明确阐明了沙利度胺的结合模式（图5）。化合物5（图4），含有异喹啉-1（2H）单元，是一种IMiD，也能够与CRBN结合并诱导底物降解。来那度胺衍生物，发现化合物6（图4）通过与CRBN相互作用导致翻译终止因子G1降解为GSPT1。化合物7（图4）作为靶向BRD4的PROTACs的CRBN配体。
（2）VHL配体：VonHippel-Lindau（VHL）是E3连接酶复合物CUL2-RBX1-ElonginB-VHL-VHL（CRL2VHL）的底物受体成分。除CRBN配体外，VHL配体也受到高度关注。在PROTAC研究中被广泛用作E3配体。
缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）增强了促红细胞生成素的表达。HIF-1α在许多生物学反应中发挥重要作用，例如代谢重编程活性氧（ROS）的产生，血管生成、上皮-间质转化和癌症转移。在HIF-1α与VHL相互作用的基础上，挖掘出一种七肽（ALAPYIP）作为第一个VHL配体。然后，利用计算机辅助设计发现了化合物8（图6）作为小分子VHL配体。化合物9（Kd = 185 nM，图6），其与VHL的亲和力远高于化合物8（Kd = 5300 nM）。此外，用1‐fluorocyclopropyl（10，Kd = 90 nM，图6）或1‐cyanocyclopropyl（11，Kd = 80 nM，图6）取代9的叔亮氨酸残基上的乙酰基，显著提高了活性。对几种VHL配体进行了比较，证明将一个甲基偶连在8位苄基上的亚甲基上有利于其活性提高（12，图6）
图6 VHL配体。
从9与VCB配合物的共晶结构可以看出（图7），叔亮氨酸残基上的氨基和苯基的苯基一侧是溶剂暴露区，可以连接连接物用于合成PROTACs。需要注意的是，乙酰基上的碳基通过水分子介导与Asn67和His115形成氢键，因此在合成PROTACs时，应保留碳基，以保持与VHL较高的结合亲和力。
图7 化合物8与VCB的共晶结构
（3）MDM2配体：MDM2是一种E3连接酶，能够加速肿瘤抑制因子p53的降解。MDM2是肿瘤治疗的重要靶点。
为了破坏MDM2-p53蛋白-蛋白相互作用（PPI）并上调p53的表达，确定Nutlin-3（图8）为MDM2配体，对MDM2抑制活性（IC50 = 90 nM）。Nutlin-3的进一步结构优化产生了化合物15（图8），其活性显著提高（IC50= 18 nM）。用吡咯烷骨架（16，图8）取代二氢咪唑（15，图8）是一个良好的结构修饰，其中16（图8）表现出更高的活性（IC50= 6 nM）。带有吡啶的其他MDM2配体（17和18，图8）、哌啶-2-1（19，图8)或二氢异喹啉酮（20，图8）的骨架也有报道。
图8 MDM2配体
（4）IAPs配体：IAP与化疗耐药、疾病进展和不良预后密切相关，其成员包括XIAP、cIAP1、cIAP2、LIVIN/ML-IAP和ILP，也可以作为E3连接酶。IAPs配体被广泛开发，并不断出现在已报道的PROTAC分子中，特别是cIAP1配体是被研究最多的IAPs配体之一。
甲基抑抑素（MetBS，图9）能够与cIAP1相互作用，促进cIAP1的自泛素化和降解。22（图9）及其衍生物为IAPs拮抗剂。22比MetBS表现出更高的结合亲和力。此外，23（图9）是一种基于结构的药物设计策略的pan-IAP拮抗剂。
基于IAP配体的PROTACs称为特异性和非遗传的IAP-依赖蛋白擦除器（SNIPERs），是针对ER、BRD4和BCR-ABL等有效降解物。
图9 IPAs配体
（5）其他的E3配体：所报道的其他E3配体列于表1。化合物24和29（表1）分别来源于与KEAP1和RNF114 E3连接酶共价连接的天然产物。
表1 其他E3配体或其相应的PROTACs
靶向激酶的PROTAC研究进展
（1）靶向BCR-ABL的PROTACs：BCR-ABL融合蛋白参与慢性髓系白血病的发生和发展。将BCR-ABL抑制剂伊马替尼、波沙替尼或达沙替尼与VHL配体9（图6）或CRBN配体波马利度胺（图4）结合，合成了一系列的PROTACs。34（图10）在1000 nM浓度下具有较好的降解活性，降解率为60%。PROTAC34能有效抑制K562细胞系的增殖，IC50为4.4 nM。此外，通过改变BCR-ABL或E3配体（VHL或CRBN配体），可以显著改变PROTAC的选择性。随后，利用针对BCR-ABL1的变构抑制剂GNF-5发现了PROTAC 35（图10）对BCR-ABL1具有亚微摩尔降解活性（DC50 = 340 nM）。在35的基础上合成36（图10），降解活性（DC50 = 30 nM）增强。
图10 针对BCR-ABL的PROTACs
基于IAP的PROTACs（也称为SNIPERs）37（图10）为BCR-ABL降解剂。37由一个CIAP1结合弹头（抑制部分）、一个BCR-abl结合弹头（达沙替尼部分）和一个烷基连接子组成。37在浓度高达30,000 nM时对BCR-ABL具有降解活性。22（图9）与IAPs具有更高的结合亲和力，当作为E3配体时，能够提高对BCR-ABL的降解活性（38，图10）。在10 nM浓度下，BCR-ABL的降解率达到50%以上。此外，38在抑制BCR-ABL下游信号通路方面比其亲本化合物达沙替尼显示出更持久的作用。在HG-7-85-01为BCR-ABL配体的情况下，VHL配体9（图6）在几种E3配体中最合适，相应的PROTAC 39（图10）在100 nM诱导BCR-ABL50%的降解。用波马利度胺（图4）或图22（图9）取代39的E3配体显著降低了脱氧活性，这表明PROTAC招募的不同E3连接酶与POI具有不同的协同性。BCR-ABL变构抑制剂ABL001 PROTAC 40（图10）作为一种有效的BCR-ABL降解剂，能够在30 nM时诱导BCR-ABL近50%的降解。
PROTAC 41和VHL配体9达沙替尼（图10）可显著促进BCR-ABL降解（DC50 = 8.5 nM），可抑制BCR-ABL驱动的K562细胞系（IC50= 24 nM）的增殖。体内研究显示，41在15mg/kg/d的剂量下显著减弱了K562异种移植小鼠模型的肿瘤生长。在点击化学平台的基础上合成了一个含有不同BCR-ABL配体的PROTACs库。PRTOAC 42（图10）作为一种有效的BCR-ABL降解剂（DC50 = 20 nM），对K562细胞系（IC50= 7.5 nM）表现出纳摩尔的抗增殖活性。此外，耐药的BCR-ABL突变体（BCR-ABLT315I）也对42敏感。基于IMiDs的叠氮化物化合物，并通过点击化学与BCR-ABL配体连接，以获得PROTACs。在这些PROTACs中，43在低至10 nM的浓度下对BCR- ABL具有较强的降解活性，并且对K562细胞系（IC50= 1.50 nM）具有较高的抗增殖活性。
采用nimbolide（表1）作为E3配体，发现PROTAC 44（图10）招募RNF114 E3连接酶。与上述BCR-ABL降解物相比，44在BCR-ABL和c-ABL之间具有更高的选择性，这表明被招募E3的连接酶是PROTAC选择性的关键决定因素之一。
（2）靶向Bruton's酪氨酸激酶（BTK）的PROTACs：BTK由BTK基因编码，除T淋巴细胞外，其余均在造血系统中表达。BTK与B细胞的增殖、分化和存活相关，使其成为非霍奇金淋巴瘤（NHL）治疗的重要靶点。靶向BTK的PROTACs如图11所示。
图11 靶向Bruton's酪氨酸激酶（BTK）的PROTACs
基于伊布替尼的PROTAC 46（图11）能有效诱导HBL1细胞（DC50 = 6.3 nM）和其他NHL细胞系的BTK降解。46还能显著抑制HBL1细胞系的增殖，其半抑制浓度值为1.5 nM，略低于伊布替尼（IC50= 2.5 nM）。重要的是，含有耐药的BTKC481SHBL1细胞系对46也有显著应答。使用BTK抑制剂CGI1746作为BTK配体，发现了PROTAC 47（图11）。47在Ramos细胞中对BTK和在TMD8细胞中对BTKC481S具有较强的降解活性。此外，47对IKZF1和IKZF3也有效，并加速其降解。Mino细胞系的增殖被47明显抑制，IC50为12 nM。体内研究表明，47在DFBL-96069移植小鼠中，以50mg/kg/天的剂量显著降低了移植小鼠的肿瘤负荷。
以伊布替尼为基础的PROTAC 48（图11）在XLA细胞系中对BTK（DC50 = 14.6 nM）和BTKC481S（DC50 = 14.9 nM）具有较强的降解活性。由于48的药代动力学特性较差，进一步优化了48的结构，使用来那度胺作为CRBN配体合成PROTAC 49（图11）。保持强大的降解活性，49比48表现出更好的药代动力学特性。延长连接子的长度有利于三元配合物的形成，提高了降解活性。
（3）靶向细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）的PROTACs：CDK是一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，调节细胞周期（CDK1、CDK2、CDK4、CDK6）和基因转录（CDK7-13）。CDK有20个成员，其中许多成员已被证明与肿瘤的发生和发展密切相关，使它们成为癌症治疗的重要靶点。
靶向CDK9的PROTACs：PROTAC 60（图12）可以选择性诱导CDK9的降解，同时保留CDK2、CDK5、蛋白激酶B（AKT）、IκB激酶β（IKKβ）和黏附激酶（FAK）。基于CDK抑制剂BMS-387032的PROTAC 61能够以CRBN依赖的方式选择性地诱导CDK9的降解。在250 nM的浓度下，CDK9在MOLT4细胞系中完全缺失，同时CDK2和CDK7的降解非常有限。相反，当BMS-387032被选择性有效的CDK9抑制剂NVP-2（半抑制浓度=0.514nM）作为CDK9配体取代，产生PROTAC 62时，降解活性降低（图12）。
图12 靶向CDK9的PROTACs
PROTAC 63是一种有效的CRBN招募CDK9降解剂。63在1000 nM浓度下，诱导CDK9降解大于50%，而CDK2、CDK4、CDK5、CDK7和CDK8完好无损。采用选择性CDK9抑制剂BAY 114357作为CDK9配体，PROTAC 64在MV4；11细胞系中发现对DCK9的DC50值为7.62 nM。64对MV4；11细胞系（25 nM）也表现出良好的抗增殖活性。此外，体内研究显示，64使CDK9在20 mg/kg剂量下在3h后显著降解。
靶向CDK6的PROTACs：靶向CDK6的PROTACs如图13所示。Palbociclib是一种CDK4和CDK6的双重抑制剂，在这两个靶点之间的抑制活性相当。尽管Palbociclib对CDK4和CDK6表现出双重抑制作用，但65选择性地加速了CDK6的降解，而由于无法诱导三元配合物（CDK4：62：CRBN）的形成，62、65几乎不影响CDK4。此外，65对CDK6依赖的细胞系比CDK4依赖的细胞系表现出更强的抗增殖活性。基于palbociclib的PROTAC 66（图13）为选择性CDK6降解剂。
以palbociclib作为CDK配体，通过改变连接子长度和改变E3配体，合成了一系列的PROTACs。只有CRBN配体对CDK6有效，并发现PROTAC 67（图13）具有显著的降解活性和高选择性。PROTAC 68（图13）选择性降解CDK6。上述CDK6靶向的PROTACs招募了CRBN，通过筛选多个E3配体发现了VHL招募的PROTAC 69。69是一种有效的CDK6降解剂，DC50值为5.1 nM。
靶向CDK8的PROTACs：天然产物皮质抑素A（图14）是一种选择性的CDK8抑制剂（IC50= 15 nM）。然而，就像大多数天然产物一样，皮质抑素A的合成也充满了挑战。通过简化的合成获得了有效的CDK8抑制剂JH-VIII-49（图14，IC50= 16 nM），活性与皮质抑素A相当。使用JH-VIII-49作为CDK8的配体，发现了PROTAC 72（图14），它在1000 nM浓度下显著诱导了Jurkat细胞中CDK8的降解。
图14 靶向CDK8的PROTAC和抑制剂
靶向CDK2的PROTAC和靶向CDK2和CDK9的PROTAC:在泛CDK抑制剂AT-7519和FN-1501的基础上报道了PROTAC 73和74（图15）。73选择性地促使CDK2在1000 nM浓度下降解，并显示出对PC‐3细胞系的细胞活性（IC50=840 nM），与AT‐7519相似。相比之下，74能够在PC-3细胞系中同时诱导CDK2（DC50 = 62 nM）和CDK9（DC50 = 33 nM）的降解。74对PC-3细胞系的IC50值为120 nM。
图15 靶向CDK2和靶向CDK2和CDK9的PROTAC
靶向CDK4的PROTAC和靶向CDK4和CDK6的PROTAC:通过改变PROTAC的POI配体，可以实现较高的目标选择性。基于核糖体的PROTAC 75和76（图16）。75可以选择性地加速Jurkat细胞系中CDK4的降解，而76对CDK4和CDK6均有效。此外，76可以以CRBN依赖的方式将Jurkat细胞阻滞在G1期。多靶点PROTAC 56对多个CDK成员也表现出降解活性。
图16 靶向CDK4和靶向CDK4和CDK6的PROTAC
（4）靶向EGFR的PROTAC
基于第一代表皮生长因子受体（EGFR）-酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）的PROTACs：EGFR的突变和过表达与非小细胞肺癌（NSCLC）的发生发展密切相关，这使EGFR成为NSCLC治疗的重要靶点。
使用第一代EGFR-TKI吉非替尼作为EGFR配体，VHL招募的PROTAC 77在HCC827细胞中对EGFRdel19具有良好的降解活性（DC50 = 11.7 nM）。在拉帕替尼的基础上合成的PROTAC 78（图17）可诱导OVCAR8细胞中EGFRWT（DC50 = 39.2 nM）的降解，而在Hela细胞中对EGFRexon20ins（DC50 = 736.2 nM）的活性较低。78对表皮生长因子受体2（HER2）有效，并能显著抑制HER2驱动的SKBr3细胞系（IC50= 102 nM）的增殖。EGFR的降解对下游效应分子AKT、糖原合酶激酶-3β和细胞外调节蛋白激酶1/2（ERK1/2）的磷酸化产生了比单纯的抑制有更持久的影响，说明了降解比抑制的优势。starvation可以提高吉非替尼衍生的PROTAC 79的降解活性（图17），在HCC827细胞中，starvation对EGFRdel19的DC50值为5.0 nM。79可以通过减少下游分子的磷酸化来显著阻断EGFR信号通路。
图17 基于第一代EGFR-TKIs的PROTACs
含嘌呤的PROTAC 80（图17），在HCC827细胞系中对EGFRdel19具有优异的降解活性（DC50=0.51 nM）。80还能有效诱导H1975细胞系中耐药突变体EGFRL858R/ T790M（DC50 = 126.2 nM）的降解。此外，PROTAC诱导的EGFR降解与自噬有关。由奥拉帕尼（聚（adp-核糖）聚合酶（PARP）配体）、吉非替尼（EGFR配体）和VHL配体组成的三价PROTAC 81（图17）能够诱导PARP和EGFR的降解，但对H1299细胞系（IC50= 19920 nM）。
基于第二代或第三代EGFR-TKIs的PROTACs：阿法替尼是第二代EGFR-TKI。以阿法替尼为基础合成了PROTAC 82（图18）在H1975细胞系（DC50 = 215.8 nM）中对EGFRL858R/T790M具有中度降解活性。
使用第二代EGFR-TKI卡纳替尼作为EGFR配体的PROTAC 85（图18）。85对EGFRdel19（DC50=30-100nM）和EGFRL858R/T790M（DC50 < 30 nM）均具有较强的降解活性。85对PC9（IC50= 3.942 nM）和H1975（IC50= 26.52 nM）细胞系表现出较强的细胞活性。研究证实，EGFR通过劫持UPS和自噬-溶酶体系统来降解目标蛋白。
利用第三代EGFR-TKI作为弹头，通过改变连接体和E3配体合成了一系列PROTACs。在H1975细胞中，最有效的PROTAC 83（图18），对EGFRL858R/T790M的DC50值为5.9 nM。然而，83对H1975细胞系（IC50= 510 nM）表现出较差的细胞活性。奥西替尼衍生的PROTAC 84（图18），在浓度为10000nM时，能够促进PC9细胞中EGFRdel19的降解。
图18 基于第二代或第三代EGFR-TKIs的PROTACs
基于第四代EGFR-TKI的PROTACs：使用第四代EGFR-TKI 86（图19）作为EGFR配体的CRBN-招募PROTAC 87（图19）和VHL-招募PROTAC 88（图19）。87和88是有效的EGFRdel19降解剂（DC50 =分别为45.2和35.8）。HCC827对87和88敏感，IC50分别为180和220 nM。但缺点在于，两种PROTACs对EGFRL858R/T790M的活性非常差。此外，87和88分别被证明能够诱导HCC827细胞凋亡，并将HCC827细胞阻滞在G1期。
图19 基于第四代EGFR-TKI的PROTACs。
基于变构EGFR-TKI的PROTAC：EAI001（图20）是一种有效的变构物EGFR-TKI。将EAI001衍生物与波马利度胺结合，合成了PROTAC 90（图20）。90能够有效诱导双突变体（EGFRL858R/T790M）和三突变体（EGFRL858R/T790M/C797S和EGFRL858R/T790M/L718Q）的降解。细胞活性评价表明，90能有效抑制EGFRL858R/T790M（IC50= 96 nM）和EGFRL858R/T790M/C797S的增殖。
图20 基于变构EGFR-TKI的PROTAC。
（5）靶向ALK的PROTACs：ALK是一种受体酪氨酸激酶，最初在间变性大细胞淋巴瘤（ALCL）的染色体易位中发现ALK融合蛋白（NPM-ALK和EML4-ALK）有助于ALK的持续激活，导致肿瘤的发生和肿瘤的发展。ALK的异常激活涉及多种肿瘤，包括ALCL、NSCLC、弥漫性大B细胞淋巴瘤、乳腺癌、结直肠癌、炎性肌纤维母细胞瘤、食管鳞状细胞癌和肾细胞癌。此外，ALK的点突变与神经母细胞瘤相关。因此，AKL是治疗癌症最重要的靶点之一。
ALK抑制剂塞瑞替尼衍生的PROTAC 91（图21）可有效降低SU-DHL-1细胞中NPM-ALK（DC50 = 3 nM）和H2228细胞中EML4- ALK（DC50 = 34 nM）的水平。91能显著抑制SU-DHL-1细胞系（IC50= 46 nM）的增殖。体内研究表明，在给药后12h（50mg/kg，腹腔注射），91在小鼠体内的血药浓度可达到340 nM，远高于其对SU-DHL-1细胞系的IC50值。基于塞瑞替尼的PROTAC 92（图21）以UPS依赖的方式显著加速了NSCLC细胞H3122（DC50 = 10 nM）和ALCL细胞Karpas 299（DC50 = 40 nM）中ALK的降解。与上述CRBN招募的PROTACs不同，含有VHL配体的PROTAC 93（图21）能有效诱导ALK降解，抑制SU-DHL-1（半抑制浓度= 58 nM）和H3122（半抑制浓度= 180 nM）细胞系的增殖。
图21 针对ALK的PROTACs
布加替尼是第二代ALK抑制剂，于2017年被批准用于治疗ALK阳性转移性NSCLC。当与EGFR抗体联合使用时，布加替尼能够克服三重突变体EGFR引起的耐药。PROTAC 95（图21）作为一种有效的ALK降解剂，可有效杀死SR细胞（DC50 = 7.0 nM）中的ALK，并显著抑制SR（半抑制浓度= 1.7 nM）和H2228（半抑制浓度= 46 nM）细胞系的增殖。95可以在293 T细胞中诱导耐药突变体ALKG1202R（DC50 < 200 nM）的降解。95对293T细胞系IC50值为146.4 nM，超过了布加替尼。CRBN-招募的PROTAC 96（图21），对SR细胞系具有强大的细胞活性，IC50值为2.0 nM，略低于布加替尼（IC50= 3.3 nM）。96在低至10 nM的浓度下均能显著诱导ALK的降解。
采用第二代ALK抑制剂阿利替尼作为ALK配体，发现了PROTAC 97（图21）。97在H3122（DC50 = 27.4 nM）和Karpas（DC50 = 116.5 nM）细胞系中对ALK具有纳摩尔级降解活性。体内研究表明，Karpas 299细胞异种移植模型给予97（10mg/kg/d）可减轻肿瘤重量75.82%，超过阿利替尼，20mg/kg/d时，肿瘤重量减轻63.82%。
（6）靶向B-RAF的PROTACs
B-RAF属于RAF家族，是RAS-RAF- MEK-ERK信号通路的一个重要节点。B-RAF的突变和过表达被认为是促进了肿瘤的发生和进展。针对B-RAF的PROTACs如图22所示。
图22 针对B-RAF的PROTACs
PROTAC 98（图22）在5000 nM浓度下可有效诱导MCF-7细胞中B-RAF的降解。B-RAF抑制剂BI882370衍生的PRTOAC 99能够显著降低A375细胞中B-RAFV600E（DC50 = 15 nM）的水平，而保留野生型B-RAF（B-RAFWT）。vemurafinib作为B‐RAF配体发现了PROTAC 100（图22），100在SK‐MEL‐28细胞中具有优异的抗B‐RAFV600E活性（DC50=6.8 nM，Dmax=95%），而抗B‐RAFWT活性较差。此外，100（EC50 = 37 nM）对SK-MEL-28细胞系的抗增殖活性优于vemurafinib（EC50 = 215 nM）。
（7）靶向其他激酶的PROTACs：靶向其他激酶的PROTACs见表（2）
表2 靶向其他激酶的PROTACs
04
靶向核受体（NR）的PROTACs研究进展
NRs是一个配体激活的转录因子家族，包括约48个成员，负责调控基因转录。NRs与许多生理和病理过程，如转移、生殖、衰老和癌症等过程有很大关系。雄激素受体（AR）和雌激素受体（ER）对前列腺癌和乳腺癌的治疗备受关注。
（1）靶向ER的PROTACs：靶向ERα的PROTAC 124（图23），由雌二醇作为ERα配体和IκBα磷酸肽（DRHDSGLDSM）组成，识别并与SCFβ-TRCP E3连接酶结合。124在10,000 nM浓度下，可促进ERα的泛素化，并有效诱导ERα的降解。然而，由于膜通透性较低，124只能通过微注射给药。为了提高渗透性，用VHL-招募的五肽取代了124的IκBα磷酸肽，产生了125（图23）。125可以增强ERα的泛素化，并促进其降解。该团队通过改变雌二醇连接体的系结位点，进一步优化了125的结构，最终得到PROTAC 126（图23）。浓度为25000 nM时，126显著增强了MCF-7细胞中ERα的降解。对126进一步修改得到了PROTAC 127（图23），可以在96 h后降解整个ERα。使用短连接子的PROTAC通常比使用长连接子的更有效。
图23 针对ERα的PROTACs
小分子PROTACs比肽型的PROTACs更具优势。将ERα配体他莫昔芬与cIAP1配体抑抑素连接，合成能够以蛋白酶依赖的方式促进ERα降解的PROTAC 128（图24）。为了进一步提高降解活性，将IAP配体从抑抑素变为22（图9），与IAP具有更高的结合亲和力，在MCF-7细胞（DC50 = 3 nM）中具有良好的降解活性。对129的IAP配体（与cIAP1的结合亲和力：IC50= 450 nM）进行深入优化，以增强结合亲和力。筛选出了PROTAC 130（与cIAP1的结合亲和力：IC50= 74 nM，图24），显著降解活性（半抑制浓度< 3 nM）。此外，130在体外抑制肿瘤细胞增殖和在体内抑制肿瘤生长方面超过了129。131在MCF-7细胞中是一种高效的ER降解剂，DC50值为0.17 nM，对MCF-7细胞系具有显著的抗增殖作用（半抑制浓度= 0.77 nM）。耐药突变体ERY573S和ERD538G在100 nM浓度的存在下显著降解，这表明PROTAC具有克服耐药的能力。
图24 靶向ER的小分子PROTACs
PROTAC 132（图24）对ERα（DC50 = 1.1 nM）表现出显著的降解活性，显著抑制MCF-7细胞系（半抑制浓度= 13.2 nM）的增殖。PROTAC 133是由阿斯利康发现，其DC50值为0.3 nM。雌二醇衍生的PROTAC 134（图24）不仅可以有效诱导ERα的降解，还可以有效诱导ERβ和G蛋白偶联雌激素受体的降解。PROTAC 135（ARV-471，图24），进入了治疗晚期和转移性乳腺癌的三期临床试验。
（2）靶向AR的PROTACs：AR对前列腺癌的发生发展有很大的作用，使其成为前列腺癌治疗的重要靶点。ALAPYIP肽可以被VHL识别和捕获。为了提高该肽的通透性，加入了一段多聚d-精氨酸，并进一步与双氢睾酮结合生成PROTAC 136。136可以诱导绿色荧光蛋白（GFP）-AR的降解。用含羟基脯氨酸的五肽作为VHL配体，合成了具有细胞通透性的PROTAC 137（图25）可诱导AR降解。
图25 靶向AR的肽PROTACs
肽类PROTACs经常存在不稳定和细胞通透性差的问题。为了克服这些缺点，将AR配体R-2与MDM2配体nutlin-3连接起来（图8），构建了一个小分子PROTAC 138（图26）。在10,000 nM的浓度下，138能有效地加速AR的降解。138是第一个促进了PROTACs在化学生物学和药物开发中的全小分子PROTAC。
图26 靶向AR的PROTAC
基于SNIPER技术，合成了IAP招募的PROTAC 139（图26），在3000 nM浓度下可显著增强22Rv1细胞AR的降解，并诱导VCaP细胞系凋亡。同时，PROTAC 140（图26）是一种高效的AR降解剂，VCaP细胞的DC50值为5 nM。此外，耐药的AR突变体对140有反应。尽管AR的过表达导致了对苯鲁胺的耐药，140仍然保持了对前列腺癌细胞的抗增殖活性。
VHL配体与含有四甲基环丁烷的AR拮抗剂偶联，合成了一系列PROTACs。其中，具有刚性连接子的PROTAC 141（图26）在AR阳性的LNCaP和VCaP细胞中表现出最强的降解活性，DC50值分别为0.86和0.76 nM。此外，141对LNCaP和VCaP细胞系具有良好的细胞活性，IC50小于1 nM。PROTAC 142的活性（图26）的活性与141相当。将142的VHL配体中引入一个4-甲基噻唑基，得到PROTAC 143（图26）。143能有效促进LNCaP细胞（DC50=8nM）中AR的降解，并显示出比恩扎鲁胺更高的抗VCaP细胞系增殖活性。
图26 靶向AR的PROTACs
CRBN招募的PROTAC144（图26）是一种有效的AR降解剂（LNCaP细胞中的DC50=12.5nM），在肝微粒体中表现出良好的稳定性、药代动力学特性和体内抗肿瘤活性。PROTAC 145（图26），在斑马鱼的VCaP细胞异种移植物中显示出显著的抗肿瘤活性。含氯乙酰胺的DCAF11配体，与AR配体结合，合成了有效的AR降解剂146（图26）。PROTAC 147（ARV-110，图26）为一种抗前列腺癌药物，已进入II期临床试验。
（3）靶向雌激素相关受体（ERRα）的PROTACs：ERRα作为NR成员之一，是与代谢和能量稳态相关的基因表达调节因子。将含噻唑烷二酮的ERRα配体与VHL配体偶联，得到PROTAC 148（图27）。结果表明，MCF-7细胞中的ERRα在148的存在下可有效降解，DC50值为100 nM。此外，148能显著促进MDA-MB-231细胞移植物体内心脏和肾脏ERRα的降解。PROTAC 149在浓度低至3 nM时，能够加速ERRα的降解。
图27 靶向ERRα的PROTACs
05
靶向其他蛋白质的PROTACs
（1）靶向BET家族的PROTACs：BET蛋白作为表观遗传的“阅读器”，能够与组蛋白和非组蛋白的乙酰化赖氨酸残基特异性地相互作用，以调节染色质动力学和基因转录。BET蛋白（包括BRD2、BRD3、BRD4和BRDT）包含两个溴结构域（BD）和一个外星结构域（ET）。
利用OTX015（图28）作为靶向BRD4的PROTAC 152。152在Namalwa和CA-46细胞中对BRD4（DC50 < 1 nM）表现出显著的降解活性。与BRD4抑制剂OTX015和JQ1相比，152更抑制下游c- MYC的表达，诱导BL细胞凋亡，抑制其增殖。基于JQ1的PROTAC 153（图28），可以通过劫持CRBN和蛋白酶体使MV4；11细胞中BRD4的完全降解。
图28 针对BET蛋白的PROTACs和抑制剂
随后，VHL-招募的PROTAC 154（图28）可有效诱导BRD2/3/4的降解，并促进CRPC细胞系的凋亡。与JQ1和OTX015相比，154可以显著降低VCaP细胞中AR的表达。体内研究表明，在30mg/kg/d的剂量下，154能够缩小22Rv1细胞异种移植物的肿瘤体积。将MDM2配体16（图8）与JQ1连接，获得PROTAC 155（图28），在HCT116细胞（DC50 = 32 nM）中对BRD4具有较强的降解活性。
PROTAC 156对BRD4的选择性高于BRD2和BRD3（图28），在100 nM可显著促进BRD4的降解。从三元配合物BRD4BD2：156：VCB的共晶结构（图29）中可以看出，叔丁基投射出一个向量，直接连接到JQ1部分。因此，从叔丁基中启动一个连接子，与JQ1结合合成PROTAC 157（图28）。观察到157选择性地促进了BRD4的消耗，而BRD2和BRD3几乎不受影响。在共晶结构解析的基础上，设计并合成了大环PROTAC 158（图28），其活性与156相当。此外，通过求解VHL：158：BRD4BD2的共晶结构，证实了三元配合物的形成。为大环PROTACs的研究提供了线索。
图29 BRD4BD2：156：VCB的共晶结构和156的化学结构
以BET抑制剂作为BET配体合成了一系列PROTACs。其中，PROTAC 159（图30）对BET表现出皮摩尔降解活性，对RS4；11细胞系具有抗增殖活性。在5mg/kg/d的剂量下，159可以减少RS4；11细胞异种移植模型的肿瘤体积。对JQ1的结构进行了优化，发现了新的有效的BET抑制剂QCA276，并在此基础上发现了PROTAC 160（图30）。160细胞维持了皮摩尔降解和细胞活性。更重要的是，在给药2周后，160剂量为5 mg/kg时，细胞异种移植物的肿瘤几乎消失。
以点击化学为基础，合成了一组JQ1衍生的PROTACs。最终，基于中尺度诊断分析，筛选出CRBN-招募PROTAC 161（图30）作为最有效的BRD4靶向PROTAC，在NCI-H661细胞中对BRD4的DC50值为200 nM。在SNIPER技术的帮助下报告了PROTAC 162（图30）。162能够加速BET、cIAP和XIAP的消耗。有趣的是，XIAP和BRD4的降解需要三元配合物的形成，而cIAP的降解只需要cIAP与162的结合和自泛素化。以7（图4）作为CRBN配体，在22Rv1细胞（DC50 = 0.32 nM）中挖掘出PROTAC 163（图30）作为对BRD4的高效PROTAC。此外，以BET为靶点的PROTAC 164（图30）和165（图30）也被报道为有效的降解剂。
图30 靶向BET蛋白的PROTACs
ABPP是功能蛋白质组学的一种策略。2019年，基于ABPP平台获得了28个基于ABPP平台的新型RNF4 E3连接酶亲电配体（表1）。然后，将28与JQ1连接，得到了能够诱导BRD4降解的PROTAC 166（图30）。26（表1）是通过ABPP筛选出的DCAF16 E3连接酶的亲电配体，可用于发现有效的BRD4靶向PROTAC 167（图30）。通过模拟29与RNF114的结合模式，利用了共价的RNF114配体EN219（表1）。EN219被证明可以作为RNF114配体，发现PROTAC 168（图30），对BRD4降解具有纳摩尔降解活性。
β-萘黄酮是芳基烃受体E3连接酶的配体。β-萘黄酮可以用来合成PROTAC 169（图30），它能够促进BET的降解。
三价PROTAC 170（图30）是通过分支连接体将两个JQ1分子与VHL配体结合而合成的。170对BET蛋白表现出皮摩尔降解活性，并比二价PROTACs表现出更持久和更高的降解效果。根据机理研究，170个与BRD4和VHL的BD1和BD2串联形成1：1：1的三元配合物。此研究为开发三价PROTACs奠定了实际基础。
（2）靶向B细胞淋巴瘤2（BCL-2）家族的PROTACs：BCL-2基因家族编码20多个调节细胞凋亡的蛋白。在这些成员中，抗凋亡蛋白包括BCL-2、BCL-XL和MCL-1被证明是癌症治疗的关键靶点。
ABT263是一种双BCL-2/BCL-XL抑制剂。利用ABT263在MOLT-4细胞中发现了有效的BCL-XL降解剂171（DT2216，图31），该细胞的DC50值为63nM，Dmax值为90.8%。171能显著抑制MOLT-4细胞的增殖，优于其亲本化合物ABT263。与BCL-2、BCL-W和MCL-1相比，171对BCL-XL的选择性更高。在MOLT-4细胞T-ALL小鼠异种移植模型中，每周腹腔注射15mg/kg，171可完全阻止肿瘤生长。重要的是，171已进入I期临床试验。CRBN-招募的PROTAC 172（图31）在WI38非衰老细胞（DC50 = 46 nM）和衰老细胞（DC50 = 44 nM）中作为选择性BCL-XL降解剂。此外，172可以有效地清除自然衰老小鼠的衰老细胞，而不会导致血小板减少，说明其毒性低于ABT263。
图31靶向BCL-2家族的PROTACs
双BCL-2/MCL-1抑制剂Nap-1衍生的PROTACs仅仅通过不同的连接子就能达到高选择性。因此，PROTAC 173和174（图31）可以分别特异性地促使MCL-1（DC50 = 700 nM）和BCL-2（DC50 = 3000 nM）的耗竭。结果证实，PROTAC触发了三元配合物的形成，并使蛋白质被蛋白酶体降解。基于BCL-XL选择性抑制剂A-1155463的PROTAC 175（图31），在THP-1细胞（DC50 = 4.8 nM）中对BCL-XL具有良好的降解活性。通过解析VCB：175：BCL-XL的共晶结构，明确了175与BCL-XL的结合模式。基于MCL-1抑制剂a-1210477的PROTAC 176（图31）也被发现是一种有效的MCL-1降解剂。
（3）靶向组蛋白去乙酰化酶（HDACs）的PROTACs：HDACs负责调节组蛋白和非组蛋白乙酰化水平，作为重要的抗肿瘤靶点。HDAC6是被研究最多的HDAC成员之一。PROTAC 177在MCF-7细胞中作为一种有效的HDAC6降解剂，DC50值为34 nM，而其他成员（HDAC1、HDAC2和HDAC4）几乎完好无损。为了解决177的不稳定性，他们用选择性HDAC6抑制剂A替换了177的HDAC配体，最终筛选出PROTAC 178（图32）。结果表明，178能显著诱导HDAC6（DC50 = 1.64 nM）的降解，并抑制MM1S细胞系的增殖。此外，178降低了IKZFs的水平。随后，建立了含有末端醛基的来那度胺类似物库，最终获得了179个（YZ065，图32）和180个（YZ090，图32），与CRBN具有较高的结合亲和力。然后，分别以179和180作为CRBN配体构建PROTAC 181（图32）和182（图32）。181和182在降解活性方面与178相当，对HDAC6也保持了高选择性。同时， MM1S（DC50 = 7.1 nM）和小鼠4935（DC50=4.3nM）细胞对HDAC6具有纳摩尔降解活性的VHL招募PROTAC 183。
图32 针对HDAC的PROTACs
HDAC6抑制剂以nexturastat A为基础的PROTAC 184（图33）能够加速HDAC6在MM1S细胞中的快速降解，DC50值为3.8 nM。随后，进一步优化184的结构，得到了PROTAC 185（图33），显示了MM1S细胞中DC50=3.2nM与184相似)和对HDAC6的高选择性。将HDAC抑制剂SAHA与抑素连接生成PROTAC 186（图33），在4 nM浓度下显著降低了HDAC1、HDAC6和HDAC8的水平。
图33 靶向HDACs的PROTACs
除HDAC6外，靶向HDAC3的PROTACs也被深入挖掘。2020年，Liao团队使用I型HDACs抑制剂SR-3558作为HDACs结合弹头合成了VHL招募的PROTAC 187（图33）。在187的存在下，MDA-MB-468细胞中HDAC3（DC50 = 42 nM）的水平显著下降，而HDAC1、HDAC2和HDAC6的水平基本保持不变。此外，187足以抑制乳腺癌细胞系T47D、MDA-MB-468、HCC1143和BT549的集落形成和生长。在RAW264.7巨噬细胞中，在CI994增加一个氟原子可以提高对HDAC3的选择性，DC50值为320 nM。PROTAC 189（图33）在1000 nM浓度下能显著诱导HDAC1、HDAC2和HDAC3的降解，而在较低浓度下对HDAC1表现出较好的选择性。
（4）靶向SHP2的PROTACs：SHP2是一种由PTPN1基因编码的磷酸酶，作为T细胞激活的调节因子和许多信号通路，包括RAS-ERK、PI3K- AKT和JAK-STAT。
PROTAC 190（图34）是KYSE520（DC50 = 6.0 nM）和MV4；11（DC50=2.6nM）细胞中对SHP2最有效的降解剂。此外，190能够有效抑制KYSE520（半抑制浓度= 660 nM）和MV4；11（9.9nM）细胞系的增殖，并降低ERK磷酸化水平。基于SHP2变构抑制剂TNO155的CRBN-招募PROTAC 191（图34）。191被证实可以促进CRBN依赖的SHP2（DC50 = 6.02 nM在MV4；11细胞中）的降解。从SHP2变构抑制剂RMC-4550中提取的CRBN-招募的PROTAC 192。192在浓度低至10 nM时有效，特异性高。此外，192被证明可以抑制MAPK信号通路，抑制KYSE-520和MV4；11细胞系的生长，与其亲本化合物RMC-4550相当。SHP2抑制剂SHP099衍生的PROTAC 193是一种具有纳摩尔降解活性的活性SHP2降解剂。Hela细胞系对193（半抑制浓度= 5.77 nM）的反应明显高于对亲本化合物SHP099（IC50= 566.12 nM）。此外，193可降低磷酸化的JNK、ERK和p38的水平。
图34 靶向SHP2的PROTAC
（5）靶向KRAS的PROTACs：KRAS是一种由kirsten大鼠肉瘤病毒致癌基因同源基因（KRAS）基因编码的GTPase，在癌症中经常发生突变。一些KRAS突变导致其持续激活，导致肿瘤发生和进展。传统上，KRAS被认为是一个不可用药的靶点，因为缺乏传统的药物结合袋和与GTP的异常高的结合亲和力的靶点，因此开发小分子抑制剂具有挑战性。随着PROTAC技术的出现，这个棘手的问题有可能会得到解决。
在NSCLC患者中，所有KRAS突变体中KRASG12C的比例高达45%-50%。波马利度胺与含喹唑啉的化合物结合合成的PROTAC 194（图35），该化合物能够结合到KRAS的II区域。194被证明可以有效诱导GFP- KRASG12C和CRBN二聚，促进GFP- KRASG12C融合蛋白的耗尽，而不影响内源性KRASG12C。大部分内源性KRASG12C位于质膜和线粒体中，而不是位于细胞质中。此外，内源性KRAS上的赖氨酸可能无法用于泛素偶联，而且在体外没有发生多泛素化。因此，内源性KRASG12C没有反应。
为使内源性KRASG12C进行降解，合成了VHL-招募的PROTAC 195（图35），195在H2030细胞（DC50 = 590 nM）和其他几种肿瘤细胞中对KRASG12C有效。此外，195可显著抑制ERK的磷酸化。表3列出了针对其他蛋白的PROTACs。
表3 靶向其他蛋白质的PROTACs
06
HaloPROTACs研究进展
HaloTag（HT）是一种改良的卤代烷烃脱卤酶，可以从脂肪族碳氢化合物中脱掉卤化物。在催化过程中，酶中的天冬氨酸与碳氢底物之间形成共价酯键。一般来说，HaloPROTAC是一种双功能分子，由能够与HT共价结合的氯烷烃链基团和E3配体基团组成。与HalT和E3结合后，HaloPROTAC将加速HT与靶蛋白融合的泛素化和随后的蛋白降解（图36）。
图36 HaloPROTAC的作用模式
使用VHL配体作为E3弹头合成了HaloPROTAC236（图37）。236在HEK293细胞（DC50 = 19 nM）中对GFP-HT7融合蛋白表现出较强的降解活性。该降解过程被证实是VHL和蛋白酶体依赖性的。236还完成了其他融合蛋白的降解，包括ERK1-HT7和MEK1-HT7。使用优化的VHL配体HaloPROTAC237（图37）。237诱导了HEK293细胞中Halo- VPS34和Halo-SGK3融合蛋白的特异性降解，DC50值在3~10nM之间。与236相比，237对Halo-VPS34表现出更强的降解活性。
图37 HaloPROTACs的结构。
07
dTAG系统研究进展
dTAG系统由Bradner团队于2018年创建。一般来说，将POI与F36V突变的fk506结合蛋白-12融合（FKBP12F36V），所得到的融合蛋白被FKBP12F36V靶向的PROTACs降解（图38），实现POI降解（图38）。
图38 dTAG技术示图
以FKBP12为靶点的PROTACs 238（图39）和239（图39）能够加速293FT细胞中FKBP12f36v-纳米荧光素酶（Nluc）融合蛋白的降解，而野生型FKBP12（FKBP12WT）的水平不受影响。为了验证该系统的实用性，238和239分别在构建的融合蛋白如FKBP12F36V-BRD4、FKBP12F36V-KRASG12V、BRD4-FKBP12F36V、HDAC1-FKBP12F36V、MYCFKBP-FKBP12F36V、PLK1-FKBP12F36V进行测试。结果表明，238和239在MV4和11细胞中对这些融合蛋白表现出纳摩尔降解活性。重要的是，238可以显著促进小鼠luc-FKBP12F36V的消耗。将VHL-招募的PROTAC 240（图39）描述为抗FKBP12F36V-KRASG12V和FKBP12F36V-EWS/FLI的有效降解剂。
图39 靶向FKBP12F36V的PROTACs
08
AdPROM系统研究进展
AdPROM系统于2016年发明。配体诱导的AdPROM（L-AdPROM）系统，如图40a所示。通过将HT与抗原稳定的突变体GFP抗体（aGFP6M）和FLAG标记物融合，构建了FLAG- aGFP6M-Halo蛋白。FLAG-aGFP6M- Halo可以识别并结合GFP-POI融合蛋白。因此，以HT为靶点的PROTAC 237（图40b）诱导FLAG-aGFP6M-Halo：GFP-POI复合物的泛素化，然后通过蛋白酶体降解。在这种情况下，aGFP6M在与GFP结合时是稳定的，在未结合时是降解，这保证了FLAG-aGFP6M-Halo与GFP-POI的比例为1：1。L-AdPROM系统成功扩展到GFP-UNC-51样激酶1（ULK1），序列相似性83成员D（FAM83D）-GFP和血清和糖皮质激素调节蛋白激酶3（SGK3）-GFP。
图40 L- AdPROM系统
（a）L-AdPROM系统的作用机制（b）237的化学结构（HaloPROTAC-E）。
为了在不构建GFP-HRAS融合蛋白的情况下实现内源性HRAS和KRAS的降解，我们表达了与HRAS抗体融合HRAS标记的HT，即FLAG-Halo- aHRAS。在237存在的情况下，内源性RAS被有效降解。
尽管AdPROM和dTAG系统具有广泛的目标适用性，但对基因操作的要求限制了它们的发展。
09
靶向蛋白解的其他技术
（1）溶酶体靶向降解嵌合体（LYTAC）和基于抗体的PROTAC(AbTAC)：PROTAC需要招募细胞内的E3连接酶，使POI被泛素化和降解。因此，PROTAC必须穿过细胞膜进入细胞，才可以达到将蛋白降解的目的。因此，可降解的POI在很大程度上局限于具有细胞内配体结合区的细胞蛋白，而细胞外POI或没有细胞内配体连接区的细胞POI是不可被降解的。此外，由于分子量高，溶解度差，PROTAC难以穿透细胞膜。LYTAC和AbTAC是一种具有细胞外功能作用的双功能分子，可用于处理细胞外POI或一些难以透膜POI。
LYTAC：LYTAC的概念是由Bertozzi于2020年提出。LYTAC是一种双功能分子，由与POI结合的抗体或小分子配体和与非阳离子的甘露糖-6-磷酸受体（CI-M6PR）结合的糖多肽组成。CI-M6PR作为一种转运体，负责将带有甘露糖-6-磷酸（M6P）残基覆盖的n-聚糖的蛋白质运输到溶酶体。POI：LYTAC：CI-M6PR形成后，三元配合物通过内化被转运到溶酶体中进行POI降解，而CI-M6PR可以被循环利用（图41）。
图41 LYTAC的作用机制
poly（M6Pn-co-Ala）（或称为poly（M6Pn），图42）与山羊抗小鼠免疫球蛋白G连接起来，生成Ab-1（图42）。当细胞与Ab-1、mCherry和小鼠抗mCherry共孵育时，观察到mCherry的摄取增加。同样，Ab-1也可以加速载脂蛋白E4（ApoE4）和转铁蛋白受体-1（CD17）在溶酶体中富集并进行降解。
图42 Ab-1的结构及其合成工艺
EGFR靶点也受到了关注。因此，将西妥昔单抗与poly（M6Pn）偶联产生Ab-2，在浓度低至10 nM时，能够促进溶酶体和ci-m6pr依赖的方式对EGFR降解。类似地，PD-L1抗体衍生的Ab-3能够加速PD-L1的消耗。
基于抗体的PROTAC(AbTAC)：AbTAC可在细胞外诱导膜蛋白的降解。AbTAC是一种重组双特异性抗体，可同时结合到细胞膜POI和E3连接酶的胞外区域。三元配合物的形成导致其内化和溶酶体降解（图43）。重组双特异性抗体Ac-1，可在MDA-MB-231细胞中结合跨膜RNF43 E3连接酶和PD-L1。因此，在MDA-MB- 231细胞以及其他肿瘤细胞（HCC827和T24）中，Ac-1以RNF43-和溶酶体依赖的方式显著降低了PD-L1的水平。
图43 AbTAC的作用机制
细胞外TPD扩大了可降解的靶点范围。然而，含抗体的分子仍然存在不稳定性和潜在的免疫原性。体内活性尚不清楚。还需要作出更多的努力来进一步验证其实用性。
（2）自噬靶向嵌合体(AUTAC)和自噬-栓系复合物(ATTEC)：自噬-溶酶体系统是降解受损或废弃细胞成分的另一个重要途径，在细胞内稳态起着关键作用。根据载体转移到溶酶体的方式，自噬分为巨自噬、微自噬和伴侣介导的自噬。巨自噬是自噬的主要类型，是指双膜吞噬细胞成分，自噬体与溶酶体融合降解物质。与UPS相比，自噬可以致更广泛的细胞成分，包括细胞器、致病蛋白、蛋白质聚集物和核酸被降解。AUTAC和ATTEC劫持巨自噬，实现POI的消耗。
自噬靶向嵌合体(AUTAC)：AUTAC由Arimoto于2019年发明，由POI配体、环鸟苷（cGMP）或其类似物部分和连接体组成。在与AUTAC结合后，POI将被自噬标签cGMP或其类似物标记，并被自噬-溶酶体系统降解。
K63连接的多泛素化在自噬降解细胞质a型链球菌（GAS）的过程中起着关键作用。GAS的s-鸟苷化与其多泛素化密切相关。因此，Arimoto假设cGMP标记的蛋白倾向于被自噬多泛素化和降解（图44）。通过将cGMP与能够与HT共价结合的氯烷烃连接，合成了AUTAC 241（图45）。241在10000nM浓度下可诱导Hela细胞中EGFP-HT融合蛋白的溶酶体降解。这一过程证实与微管相关蛋白1A/1B轻链3B（LC3）、p62和自噬相关基因（Atg5）相关，表明EGFP-HT被自噬降解。
图44 AUTAC的动作模式
图45 靶向不同POIs类型的AUTAC
进一步优化cGMP以提供对氟苄基鸟嘌呤（FBnG），用于合成FBnG衍生的AUTAC 242（图45），以加速AUTAC与EGFP‐HT的反应，并避免cGMP依赖性蛋白激酶G激活引起的潜在副作用。242被证实能够促进EGFP- HT的降解。为了验证该策略的实用性，分别基于MetAP2、FKBP12和BET配体生成了AUTACs 243、244和245（图45）。这些化合物分别能有效地诱导MetAP2、FKBP12和BET的降解。为了探讨AUTAC对线粒体吞噬的影响，将能够与线粒体结合的2-苯乙烯类似物与FBnG偶联，生成246（图45）。研究表明，246可以促进Detroit 532号21三体细胞的线粒体自噬，加速线粒体的再生，从而提高线粒体的功能。证实AUTAC促使k63泛素化。然而，多聚泛素链附着在载体上的确切机制仍不清楚。
ATTEC：ATTEC能够通过自噬诱导POI降解（图46）。
图46 ATTEC的动作模式
LC3是一种自噬小体相关蛋白，当自噬小体延长时，从（LC3-I）转化为LC3-II。LC3-II被整合在吞噬体中，作为自噬受体，负责与泛素化底物结合的适配器蛋白结合。一个能够同时参与突变的mHTT蛋白和LC3的小分子能够将mHTT“拖到”自噬小体中，通过自噬降解（图46）。247和248（图47）被证明可以加速HD敲除小鼠模型中初级皮层神经元中mHTT的降解。247和248具有内酰胺基双环结构和卤素取代芳基，证实能够与LC3和mHTT相互作用。在247和248的结构基础上，一步筛选出了249和250个（图47），它们对mHTT也有效，而野生型HTT保持完整。
图47 靶向mHTT的ATTECs
尽管ATTEC取得了成就，但它们与LC3的作用模式仍不清楚。对动作模式的阐明有助于合理设计ATTEC。此外，LC3配体也可用于设计双功能化合物，利用自噬-溶酶体系统诱导POI降解。
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分子胶研究进展
分子胶是一种蛋白-蛋白相互作用（PPI）稳定剂，它能够与蛋白质结合，使其能够与新底物相互作用。
环孢素A（CsA）是一种免疫抑制剂，具有分子胶的作用。CsA可诱导亲环素和钙调神经磷酸酶之间的PPI抑制钙调神经磷酸酶，降低T细胞活性。雷帕霉素，另一种分子胶，于1999年被FDA批准用于预防患者的器官排斥反应。雷帕霉素可与FKBP12结合形成fkbp12-雷帕霉素复合物，该复合物与哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）相互作用，发挥其免疫抑制功能。IMiDs（图4）当与CRBN结合时，可以降低IKZF1/3和酪蛋白激酶1（CK1α）的水平。从沙利度胺与CRBN的共晶结构可以看出（图4），戊二酰亚胺基团延伸到三种色氨酸定义的口袋中，而邻苯二甲酰亚胺则面向溶剂区域，调节与底物的相互作用。对来那度胺进行修饰得到了6（图4），可以诱导一种新的底物GSPT1的降解，说明在分子胶上的结构修饰可以改变底物的范围。植物激素生长素是一种分子胶，能够诱导SCFTIR1 E3连接酶与生长素/indole-3-乙酸（Aux/IAA）相互作用，降解Aux/IAA，调节植物的生长。磺胺类抗肿瘤药物251-254（图48）发挥了分子胶的作用，与DCAF15结合，促进剪接因子RBM39的降解。
图48 报道分子胶
基于对肿瘤细胞系的药物敏感性和与E3连接酶信使RNA的相关性，从临床和临床前药物库中筛选出与适配体蛋白DDB1相关的CDK12抑制剂257（CR8，图48）能够在不需要底物受体的情况下诱导CDK12-细胞周期蛋白K与CUL4-RBX1-DDB1的相互作用，诱导细胞周期蛋白K的降解。复合物CDK12-cyclin K：257：DDB1的共晶结构（图49）表明，（吡啶-2-yl）苯基在稳定DDB1与CDK12之间的相互作用中起到了至关重要的作用（图49b）。
图49 257（CR8）诱导的细胞周期蛋白K泛素化
（a）257对细胞周期素K泛素化的作用模式（b）257与DDB1和CDK12的结合模式
258和259（图48）作为cyclin K和RBM39的降解物。从机制研究中看出，259结合到CDK12的催化区域，诱导不需要底物受体的CDK12和DDB1相互作用，而258加速了底物受体DCAF15中RBM39的耗尽，这与磺胺类化合物251-254一致。
分子胶在细胞通透性和药代动力学特性方面似乎优于PROTAC，使其成为一种很有前途的临床应用降解剂。然而，天然的分子胶稀少，其结构生物学、分子机制和结构活性关系特征较差，分子胶的合理设计充满了挑战。
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PROTACs诱导的光控蛋白降解
PROTAC主要有两种类型。一种类型是具有光可裂解保护基团的光响应脱笼PROTACs，它采用光敏性基团先遮挡分子的活性部位;当分子转运到特定部位和组织中再采用光照切断光敏性基团恢复PROTACs的活性,开启靶蛋白的降解。另一种是具有光敏基团的可光切换PROTACs，其构象可以通过光刺激改变，使PRTOACs在活性和非活性构象之间转换。
（1）光响应脱笼PROTACs：邻硝基苄基经常用于光笼PROTACs。将保护基团4,5-二甲氧基-2-硝基苄基连接到靶向BRD4的PROTAC 153上（图50），得到了不活跃的光笼化PROTAC 260（图50）。在365 nm的光刺激3 min后，可以快速去除定向基团，所得到的活性PROTAC 153有效地诱导了BRD4的降解。此外，在260存在的情况下，在斑马鱼胚胎中也可以实现BRD4的光控制降解。
图50 光笼中的PROTAC 260通过光转化为有源的PROTAC 153。
同样，来自BTK降解剂48（图11）的光笼化PROTAC 261（图51）也被证明在光刺激下能有效诱导BTK的降解。根据保护基团4,5-二甲氧基-2-硝基苄基，报道了靶向BET和ALK的光笼PROTAC 262和263（图51）。在VHL配体上的羟基上附着一个庞大的基团可以阻断与VHL的结合，从而使羟基成为光裂解基团修饰的理想位置。将4,5-二甲氧基-2-硝基苄基结合到VHL配体上，合成光笼化PROTAC 264（图51）。在365 nm光刺激下，保护基团被快速裂解，释放活性PROTAC，降解BRD4。此外，采用二乙基香豆素（DEACM）和6-硝基哌酰基羟甲基（NPOM）作为保护基团，发现了光笼PROTAC 265和266（图51），分别诱导了ERRα和BRD4的降解。
图51 光笼中PROTACs（photocaged PROTACs）的结构。
（2）光响应开关型PROTACs(photoswitchable PROTACs)：功能偶氮苯经常被用作光开关，因为它在受到光刺激时可以在反式和顺式构象之间转换。将四氟偶氮苯部分偶联到连接剂上，可得光切换的PROTAC 267（图52）。在530 nm光照射下，活性反式-267可转化为非活性顺式-267。顺式-267被证明不能诱导BRD2的降解，因为连接子距离较短（8 A，图52）不有利于三元配合物的形成。重要的是，与光笼中的PROTACs不同，这种光刺激的构象转换是可逆的。对BRD2的降解活性可以通过415 nm光的刺激来逆转，使顺式-267转化回活性的trans-267（图52）。
图52 光开关267的反式和顺式构象之间的转换
BET靶向的光切换PROTAC 268（图53）。与267相比，顺式-268是活性构象，可以加速BRD2、BRD3和BRD4的耗竭。顺式268可以在无光条件下缓慢转化为trans-268，或在525nm光条件下快速转化为trans-268，恢复BET水平。利用光开关PROTAC 269对FKBP12的可逆光控制降解（图53）。紫外光可以将270转化为非活性的顺式-270，而可见光可以将顺式-270转化为反式-270。
图53 光切换PROTACs的结构及其构象的相互转换。
蛋白质降解的时空控制被认为是一种革命性的策略，以实现体内的组织选择性和降低PROTACs的潜在毒性。光笼和可光开关PROTACs也存在一些限制。光敏部分的掺入提高了PROTAC的分子量。此外，偶氮苯在体内也可能是不稳定的。此外，光引起的组织损伤也不容忽视。这些缺点需要耐心解决，以扩大光控制PROTAC的效用。
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疏水标记技术研究进展
疏水标签可以模仿部分错误折叠的蛋白，它可以被伴侣识别并进行蛋白酶体降解。因此，用含高脂肪的标签标记POI将是治疗TPD的有效方法。
富维司特（图54）是一种选择性雌激素受体下调调节剂（SERD）。根据作用模式，富维司特的疏水链被认为模拟部分变性的内质网，这导致内质网降解。为了提高氟维司特的口服生物利用度，引入了一个硼酸基团发现了SERD 272（图54）。272可诱导T47D细胞中ERα的降解，DC50值为7.8 nM。根据内质网配体，将一系列疏水部分连接到内质网配体上，筛选出273（图54）作为抗ERα的高效SERD（DC50=0.4nM）。
图54 疏水部分标记的小分子
除富维司特中的脂肪链外，金刚烷基也经常被用作POI降解的标签。将金刚烷基与HT配体结合，合成了274个（图54），对血凝素（HA）、增强绿色荧光蛋白（EGFP）和HT融合蛋白（HA-EGFP-HT）表现出纳摩尔降解活性。值得注意的是，跨膜融合蛋白包括Ror2-HA-HT、CD3E-HA-HT、CD9-HA-HT、GPR40-HA-HT和Frizzled-4-HA-HT可被蛋白酶体降解。含金刚烷的275（图54）是一种有效的AR降解剂，在LNCaP细胞中对AR具有微摩尔活性。同时，基于共价HER3抑制剂，276（图54）可以促进HER3的降解。将PLK1抑制剂与金刚烷基结合生成277（图54），在50000nM浓度下能够显著加速PLK1的消耗。此外，277被证明可以提高Hela细胞的凋亡率，比其亲本化合物Poloxin-2更有效。使用AR拮抗剂RU59063作为AR配体，在点击化学的帮助下，产生了一些选择性雄激素受体下调调节剂。最终，278（图54）为一种有效的具有微摩尔活性的AR降解剂。同时也证实了278能诱导LNCaP细胞轻度凋亡，并将细胞周期抑制在G0/G1期。
Boc3Arg也能作为TPD的疏水标记。279和280（图54）被证明能够在非常高的浓度下分别诱导谷胱甘肽-s-转移酶α1和二氢叶酸还原酶的降解。Boc3Arg增强的降解依赖于蛋白酶体，而不需要泛素化。
疏水标记技术扩展了TPD的应用范围。可以被PROTACs降解的目标可以通过疏水标记的小分子来解决。然而，强疏水性导致的溶解性和渗透性较差，往往限制了这些降解剂的生物活性。
结 语
PROTACs扩大了可成药靶点的范围，并为克服小分子抑制剂的缺点提供了一个强大的工具。到目前为止，大量的PROTACs已经用来降解70多个靶标。这些靶点包括不可用药靶点如tau、RAS和转录因子，以及耐药突变体如BTKC481S、ERY573S、ERD538GR、ALKG1202R、BCR-ABLT315I、EGFRL858R/T790M、EGFRL858R/T790M/C797S。靶向ER的ARV-471是口服可用的PROTACs，已进入三期临床试验。ARV-110患者在治疗6周（280 mg/day）后的活检中可诱导70%-90%的AR降解。其他几个针对BCL-XL、BTK和IRAK4的PROTACs也大量进入了临床试验。这些成果验证了PROTACs相对于小分子的独特优势，并验证了其临床实用性。其他的TPD技术，包括LYTAC、AbTAC、AUTAC、ATTEC、分子胶、光控PROTAC和疏水标记的小分子，也为实现POI的有效降解开辟了途径。
由于高分子量和复杂的化学结构，PROTACs通常被认为具有较差的药代动力学特性。大多数PROTACs是通过静脉或腹腔注射给予的，降低了患者的依从性。然而，考虑到ARV-110和ARV-471是口服给药的，这个问题似乎可以通过结构优化来解决。例如，简单的连接子修饰可以作为改善药代动力学特性的可行方法。此外，最近的研究表明，PROTACs倾向于采用折叠结构来穿透细胞膜。因此，分子量可能不再是药代动力学特性的主要限制。
人体内有600多种E3。遗憾的是，现在可以被降解者招募的E3连接酶的数量非常有限。CRBN和VHL配体由于其结构简单和相对已知的药理作用，现在经常被广泛使用。发现其他E3连接酶的配体是非常必要的，因为在PROTACs中使用的E3配体与PROTACs的生物活性和选择性密切相关。E3配体的开发也将扩大PROTACs可降解的靶点的范围。当然，随着研究人员的许多努力，E3连接酶可以被招募的范围将会被扩大。
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