香港科技大学唐本忠院士团队与山东大学于晓强教授团队：能够长程追踪线粒体的非反应型线粒体荧光探针
香港科技大学唐本忠院士团队与山东大学于晓强教授团队在Chem. Sci.上发表了题为“Reaction-free and MMP-independent fluorescent probes for long-term mitochondria visualization and tracking”的研究论文，报道了能够长程追踪线粒体的非反应型线粒体荧光探针。
工作意义与研究现状：
追踪线粒体形态和数目的动态变化对生理学、病理学和药理学的相关研究具有重要意义。传统的基于静电吸引的线粒体探针不能长程追踪线粒体，由于线粒体膜电位降低时这些探针会从线粒体上掉落。反应型线粒体追踪探针虽然不受线粒体膜电位变化的影响，但是这些探针会破坏线粒体的蛋白从而产生较大毒性。因此，开发非反应型、具有较好生物相容性且不受线粒体膜电位影响的线粒体追踪探针仍然是具有挑战性的工作。
设计思路：
众所周知，大部分细胞质膜探针如DiI和DiO等都具有长亲脂性脂肪链（即长烷基链）。这些探针仅依靠长脂肪链与细胞质膜磷脂的疏水相互作用便能够染色固定细胞的细胞质膜。受此设计思路的启发，并考虑到线粒体也具有与细胞质膜相似的膜结构，作者在普通阳离子型线粒体探针上引入一条长亲脂性脂肪链以实现对线粒体的追踪，如Scheme 1（1C）所示。一旦线粒体膜电位降低或者消失，静电相互作用会降低或消失，但是长亲脂性脂肪链与线粒体内膜磷脂的疏水相互作用仍然会使探针固定在线粒体上。与共价键不同，这个疏水相互作用属于非共价键的相互作用，不会对线粒体蛋白造成破坏，使探针具有更好的生物相容性。
（来源：Chem. Sci.）
共染实验：
接下来，作者将ECPI-12和IVPI-12分别与商业化线粒体追踪探针（MTDR）进行共染实验。作者分别在正常活细胞、用CCCP处理的活细胞以及用多聚甲醛固定的细胞中进行了该实验。实验结果表明，如Fig. 1A和B所示，在线粒体膜电位正常、降低和消失三种状态下，ECPI-12和IVPI-12与MTDR的共定位系数均较高。这表明ECPI-12和IVPI-12能够实现对线粒体的专一染色并不受线粒体膜电位的影响。
（来源：Chem. Sci.）
机理探讨：
为了证明当线粒体膜电位降低或消失时，是长烷基链的作用使ECPI-12/IVPI-12固定在了线粒体上，作者合成了它们对应的短链分子ECPI-2/IVPI-2，然后将短链分子对细胞染色后进行细胞成像。如Fig. 1C所示，在正常活细胞中，两个短链分子能够染色线粒体。然而，加入CCCP后，ECPI-2的染色图样从花丝状变为在细胞中分布的点状，IVPI-2进入了细胞核并染色了核仁。这一结果表明这两个短链分子在线粒体膜电位降低后不能染色线粒体。需要注意的是，ECPI-12/IVPI-12和对应的ECPI-2/IVPI-2在结构上唯一的不同是吡啶盐端接入的烷基链长度不同。因此，作者得出结论：长烷基链的作用使得ECPI-12/IVPI-12在线粒体膜电位降低时仍能固定在线粒体上。
追踪线粒体自噬：
作者用ECPI-12和IVPI-12追踪线粒体自噬过程。HeLa细胞先由ECPI-12/IVPI-12和溶酶体追踪探针（LTDR）染色，然后用10 µM CCCP和7.5 µM pepstatin A诱导线粒体自噬。随着诱导时间的增加，ECPI-12/IVPI-12与LTDR的荧光信号逐渐重叠，ECPI-12/IVPI-12与LTDR的共定位系数分别从0.15增加到0.81和从0.25增加到0.82，如Fig. 2所示。实验结果表明ECPI-12和IVPI-12能够原位、实时追踪线粒体自噬。
（来源：Chem. Sci.）
毒性实验：
ECPI-12、IVPI-12和MTDR在HeLa细胞中的毒性可通过MTT实验来测试。如Fig. 3所示，用低浓度的ECPI-12和IVPI-12孵育HeLa细胞48 h后，HeLa细胞的存活率高于80%。然而，用同样浓度的MTDR孵育HeLa细胞48 h，HeLa细胞存活率降低，尤其是当浓度增大时细胞存活率降低较为明显。实验结果表明，ECPI-12和IVPI-12与反应型的线粒体追踪探针MTDR相比具有更低的毒性和更好的生物相容性。
（来源：Chem. Sci.）
小结：在此工作中，作者合成了两个带有长烷基链的非反应型荧光线粒体追踪探针ECPI-12和IVPI-12。共染实验证明ECPI-12和IVPI-12能够实现对线粒体的专一染色并不受线粒体膜电位的影响。与短链分子ECPI-2和IVPI-2的对比表明，长烷基链的作用使得ECPI-12/IVPI-12在线粒体膜电位降低时仍能固定在线粒体上。ECPI-12和IVPI-12能够原位、实时追踪线粒体自噬，并且具有低毒性和较好的生物相容性。该工作为设计其他细胞器追踪型探针提供了新思路。
该论文的第一作者是张若瑶博士，牛广乐博士为共同一作。香港科技大学唐本忠院士和山东大学于晓强教授为共同通讯作者。该研究得到国家自然科学基金委、山东省自然科学基金委等经费支持。
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