【药化】Angew：利用酶解和生物正交反应精准控制胶束释放药物！

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生物正交反应已经成为了一种研究和调控生物过程的重要工具，而可以在活细胞及生物体内进行的生物正交反应为其在生物医学领域的应用奠定了基础：一方面，生物正交偶联反应为成像和治疗提供了预靶向策略；另一方面生物正交裂解反应为活性物质的选择性递送带来了新方向，其主要通过四嗪类物质和环辛烯的反应实现药物的选择性活化或者释放。尽管如此，目前设计在活体特殊部位实现自动和选择性的裂解反应仍然是一大挑战。近日，法国巴黎萨克雷大学Frédéric Taran教授团队和普瓦提埃大学Sébastien Papot教授团队合作，发展了一种新的生物正交裂解反应实现了响应性胶束在实体瘤内的程序性降解，从而实现药物的控制释放（Figure 1），相关研究成果发表在Angew. Chem. Int. Ed.上（DOI: 10.1002/anie.201902137），题为“Controlled Release of Micelle Payload via Sequential Enzymatic and Bioorthogonal Reactions in Living Systems”。

（图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.）

作者合成了一种两端分别为亲水聚乙二醇和疏水饱和脂肪链、中间为iminosydnone偶联剂的两亲性分子5，其中iminosydnone可以通过Strain-Promoted Iminosydnone−Cycloalkyne Cycloaddition（SPICC）释放带氨基的活性物质。这个分子可以在水中组装形成10 nm左右的M5胶束，其临界胶束浓度为50 μM，这种胶束在pH 7.4的条件下很稳定（Figure 2）。由于胶束是一种超分子组装体，因此在水溶液中疏水的分子倾向于进入其疏水内核中，这就导致了疏水分子在疏水内核中的富集，作者推测这种现象可能加快内核中发生SPICC的速度。为了验证这个猜想，作者先检测了分子5和二环[6.1.0]壬炔（BCN）在DMSO和水中的反应速度，结果发现水中的反应速度比DMSO中快44倍，而通过增加炔基分子的疏水性可以进一步提高水中的反应速度，而5与DBCO-NH₂的反应速度最快，其二阶动力学常数高达71.2±1.5 M^-1·sec^-1。

（图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.）

由于这种SPICC反应可以加快胶束的去PEG化及解组装，因此作者将疏水荧光分子DiO及其淬灭剂Dabcyl-C5一起包载在疏水内核中使DiO的荧光淬灭，一旦发生SPICC导致胶束解组装，就会释放DiO及其淬灭剂Dabcyl-C5，从而检测到DiO的荧光。作者将这种胶束和最有效的BCN-C5以及DBCO-NH₂共同孵育，发现数分钟之后DiO就完全释放，DLS分析也表明胶束完全解组装（Figure 3）。这就验证了生物正交的SPICC反应可以控制胶束内核分子的释放。

（图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.）

为了增加这种反应的选择性，作者设计了可激活为DBCO-NH₂的前体分子DBCO-glu，这是一个包含葡糖苷酸、一个自降解偶联剂、一个糖基化聚乙二醇和DBCO的两亲性小分子，由于糖基化聚乙二醇和葡糖苷酸的强亲水性，这个小分子很难进入胶束内核，一旦β-葡萄糖醛酸酶切除葡糖苷酸，就会通过自降解反应释放出DBCO-NH₂，此时它可以进入胶束发生SPICC反应，诱导胶束解组装和内核药物的释放。通过将DBCO-glu和M5胶束在有酶或者无酶的条件下进行共孵育，作者发现β-葡萄糖醛酸酶确实可以显著增加SPICC的反应速度，因此在这种体系中酶解反应对于启动胶束的SPICC裂解是必需的。接下来，作者将M5-DiR胶束与KB细胞一起孵育2小时，使细胞吞噬胶束，然后换掉培养基，随后通过检测DiR的荧光来检测SPICC的反应速度。作者发现在没有β-葡萄糖醛酸酶的情况下，DBCO-glu无法促进SPICC的发生及DiR的释放，而一旦加入β-葡萄糖醛酸酶，细胞中DiR的荧光就显著增强，这表明这种酶解介导的SPICC反应可以在细胞内发生（Figure 4）。

（图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.）

最后，作者在小鼠体内验证了这种点击释放的策略（Figure 4）。首先，作者通过尾静脉给KB口腔上皮癌的小鼠注射M5-DiR胶束后，胶束可以通过增强渗透和滞留效应（EPR）富集在小鼠肿瘤部位，24小时后的活体荧光证明了这一点：胶束高效富集在了肿瘤部位。随后，作者给小鼠注射了DBCO-glu或者PBS，45分钟后处死小鼠取出肿瘤进行荧光成像，结果发现注射DBCO-glu的小鼠肿瘤的荧光强度显著高于PBS组，作者也通过超高液相色谱/高分辨率质谱（UPLC/HRMS）联用在肿瘤组织中检测到了反应产物吡唑6和糖基化聚乙二醇，这表明β-葡萄糖醛酸酶敏感的DBCO-glu可以选择性激活肿瘤组织中的SPICC反应，促进内核药物的释放。

综上所述，作者首次开发了一种生物正交点击反应驱使的响应性胶束，可以利用胶束的组装特性使疏水分子进入并富集在其疏水内核中，引发SPICC反应加速胶束的破坏，从而加速包载的药物释放。为了增强这种反应的肿瘤特异性，作者设计了酶响应的引发分子，可以在β-葡萄糖醛酸酶的酶解作用下释放DBCO，引发后续反应。作者在细胞和动物活体水平验证了他们的这种概念，表明这种方法可以用于组织特异性的定位和药物控制性的释放。