【生化】嫌标记麻烦？细胞内直接生成荧光生物传感器

蛋白质是生命的物质基础，以人体为例，蛋白质一般占人体全部质量的18%，而作为构成细胞的基本物质，蛋白质的含量甚至超过了细胞干重的70%。此外，蛋白质还是生命活动的主要承担者，它参与了几乎细胞内所有的生命活动。但是蛋白质的结构和功能受细胞环境的影响极大，即使相同的蛋白质，在细胞内不同位置也可以表现出不同的活性，因此对蛋白质构象的动态检测在分子诊断和生物医学研究方面具有重要的意义。针对这一问题，学者们开发出了一系列荧光生物传感器，其中又以基于荧光共振能量传递（fluorescence resonance energy transfer, FRET）及基于共价标记的环境敏感型荧光染料的生物传感器最具代表性，尤其是后者，因为相比于蛋白质，染料通常具有更高的亮度，因此可以带来更为精确的检测结果。

图1. 染料的结构及其细胞穿透性

（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

近日，美国北卡罗来纳大学教堂山分校的Klaus M. Hahn教授课题组及其合作者报道了一种环境敏感型荧光探针（图1），这种探针可以通过对侧链的修饰从而有效地穿透细胞膜，并且在此过程中并不会粘附在细胞内。不仅如此，通过非天然氨基酸突变，该探针可以选择性地与蛋白表面的小分子进行结合，从而实现生物传感器的功能。该成果以“Membrane-Permeant, Environment-Sensitive Dyes Generate Biosensors within Living Cells”为题发表于《美国化学会志》（DOI: 10.1021/jacs.8b09841）。

图2. mero76的合成路线

（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

对于探针的设计，作者选取了部花青染料作为探针的母体结构，这种染料会因为环境极性的变化和氢键相互作用而表现出明显的荧光强度变化，是一种理想的环境敏感型探针。但是部花青染料的细胞穿透性极差，虽然可以通过侧链的修饰进行改善，但是这种方式会使得染料在进入细胞后会黏附在多种亚细胞器上。因此，为了解决这个问题，作者在平衡了亮度、光稳定性、溶剂敏感性等性能后选择了以假吲哚-巴比妥酸染料（I-BA）为基础的探针母体，并在染料上的不同位置进行了不同的修饰（图1）。结果表明，不同基团的修饰赋予了染料不同的细胞穿透性，其中含有两个乙酰氧基甲基（acetoxymethyl，AM）基团的染料具有最佳的细胞穿透性。

图3. 探针的细胞核定位效果

（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

接着，作者以含有两个AM结构的染料mero76为基础（图2），在巴比妥酸上修饰了DNA甲基转移酶G9a的配体并通过早代小鼠胚胎成纤维细胞（MEF cells）检测了探针的定位效果。结果表明，含有G9a的探针在进入细胞后主要富集在细胞核中，而没有G9a修饰的探针则弥散分布于细胞内（图3）。

最后，作者在证实了mero166可以在细胞内实现标记的前提下，利用该探针实现了GTP酶Cdc42构型的检测。

全文作者：Christopher J. MacNevin, Takashi Watanabe, Matthew Weitzman, Akash Gulyani, Sheryl Fuehrer, Nicholas K. Pinkin, Xu Tian, Feng Liu, Jian Jin and Klaus M. Hahn。