【生化】Angew：具有双反应性的荧光探针用于检测细胞内的HSNO

硫氰酸（HSNO）作为一种最小的S-亚硝基硫醇，是连接H₂S和NO两个信号分子的关键中间体，能够调节细胞的氧化还原状态。目前为止，傅立叶变换红外吸收光谱仪（FTIR），¹⁵N核磁共振（¹⁵N NMR）和质谱（MS）已成功用于生理条件下HSNO的检测和表征。然而，这些方法对实时监测生物样品中的HSNO并不适用。因此，为更好地理解HSNO在生理环境中的作用，具有高灵敏性和时空分辨能力的荧光成像技术表现出极强的应用潜力。

近日，美国华盛顿州立大学化学系鲜明教授设计合成了一种用于检测HSNO的荧光探针TAP-1（Scheme 1）。TAP-1的荧光被羟基保护基和分子内螺旋环化效应完全淬灭，背景荧光较低。HSNO存在时，2-巯基苯甲酸酯部分亲核反应以及分子内环化释放苯并二硫醇和化合物2；同时，HSNO与邻苯二胺反应形成苯并三唑衍生物3。随后，荧光团的共轭体系恢复，表现出强烈的荧光。值得一提的是，单独的多硫化物仅与2-巯基苯甲酸酯部分反应，产生的化合物2由于分子内螺旋环化和光诱导电子转移（PET）过程不显示荧光。相关成果以“Rational Design of a Dual-Reactivity Based Fluorescent Probe for Visualizing Intracellular HSNO”为题发表在Angew. Chem. Int. Ed.上（DOI: 10.1002/anie.201908950）。

（来源：Angew. Chem. Int. Ed.）

首先，作者探究了探针TAP-1的合成（Scheme 2）。以化合物4为原料，其与N-Boc-1,2-苯二胺发生偶联反应，随后用LiOH处理生成化合物5。化合物5的酰胺键经硼烷还原，并用四氯苯醌氧化得到化合物6。然后化合物6经过一系列酯化、去保护和还原反应，得到目标探针TAP-1。

（来源：Angew. Chem. Int. Ed.）

随后，作者测试了TAP-1对HSNO的响应性。作者将HSNO（1 mM）和Na₂S（0.3 mM）的PBS缓冲液（50 mM，pH 7.4）作为HSNO母液，进行后续实验。与预期结果一样，TAP-1在PBS中几乎无荧光发射（Φ=0.01）。而在HSNO溶液（50 μM）存在下，TAP-1在521 nm处表现出明显的荧光发射峰，且在8 min后达到稳定状态（Figure 1A）。作者进一步验证了TAP-1对HSNO的选择性，发现约16种活性物质（GSH、Hcy、Cys、Na₂S、ONOO^-等）均不会使TAP-1响应并产生荧光，而TAP-1在Na₂S和吡咯烷-NONOate的混合溶液中表现出较弱的荧光（Figure 1B）。作者猜测H₂S和NO的相互作用产生了HSNO。

（来源：Angew. Chem. Int. Ed.）

接下来，作者探究了TAP-1在细胞中HSNO的成像能力。CCK-8实验表明TAP-1表现出低细胞毒性和良好的生物相容性。基于此，作者将Hela细胞与TAP-1（10 μM）共孵育，并未观察到显著的荧光信号（Figure 2a）；随后用Na₂S/S-亚硝基谷胱甘肽（GSNO）的混合物处理细胞，观察到明显的荧光信号（图2d）；用Na₂S/吡咯烷-NONOate的混合溶液处理细胞，也观察到类似的结果（图2e）。有趣的是，仅用吡咯烷-NONOate处理细胞也表现出一定的荧光信号（Figure 2f），这可能是因为内源性的H₂S与NO反应生成HSNO。然而，用H₂S合成抑制剂PAG预处理后，荧光信号明显减弱（Figure 2g）。以上结果均表明TAP-1具有良好的细胞渗透性，可用于细胞内HSNO的检测。

（来源：Angew. Chem. Int. Ed.）

最后，作者在人胚肾细胞（HEK293T）中探究了TAP-1的成像效果，进一步探究了TAP-1在细胞内可视化HSNO的效率。线粒体中的半胱氨酸-tRNA合成酶（CARS2）有助于内源性H₂S的产生，而NOC7是NO的供体。结果发现，用NOC7处理的野生型（WT）HEK293T细胞比CARS2敲除（KO）的具有更强的荧光响应，并且该响应表现出NOC7浓度依赖性。以上结果表明，TAP-1可以与内源性HSNO反应，而内源性HSNO主要产生于CARS2衍生的H₂S与NO的反应。

（来源：Angew. Chem. Int. Ed.）

总而言之，作者报道了一种双反应性的荧光探针TAP-1用于HSNO的检测，并在体内外均实现了对HSNO的高选择性和高灵敏性的响应，该探针有望成为探究生物系统中HSNO功能的重要工具。

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