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【生化】ACS Cent. Sci.:具有自发闪烁标记的荧光标签的设计用于超分辨成像

阳光ATP CBG资讯 2022-06-22


小分子荧光团是生物学研究的基本工具。罗丹明由于具有较高的荧光量子产率、较好的光稳定性、结构的可修饰性以及非荧光内酯(L)和荧光两性离子(Z;平衡常数:KL-Z)之间的可逆转化等特性,已经被广泛应用于生物成像,如生物分子标记、细胞染色、环境检测等。其中,通过调整KL-Z降低亲脂性非荧光内酯的形成可以改善细胞渗透性,产生“荧光”配体,与生物靶标结合后显示出显著的荧光信号。


近日,美国霍华德·休斯医学研究所珍妮亚研究院的Luke D. Lavis博士基于罗丹明荧光团设计合成了一种新型荧光团Janelia Fluor(JF526,其形成自我标记的配体,用于内源结构的染色以及超分辨免疫荧光的自发闪烁标记。相关成果以“Rational Design of Fluorogenic and Spontaneously Blinking Labels for Super-Resolution Imaging”为题发表在ACS Central Science上(DOI: 10.1021/acscentsci.9b00676)。



(来源:ACS Central Science

 

四甲基-Si-罗丹明(SiR,1;Figure 1a)是一种常见的荧光染料,表现出远红外波长,最大吸收波长为643 nm,发射波长为662 nm,荧光量子产率为0.41(Table 1),且具有优异的光稳定性。基于SiR的配体具有较低的KL-Z值(0.0034),说明其在水溶液中是非荧光内酯的形式,具有高度可渗透性。然而,这类配体与分子靶标结合后会使平衡向两性离子转变,产生荧光(Figure 1b)。另外,作者发现用四元氮杂丁烷环替代荧光团中的N-二甲氨基可以改善物质的性质,因此作者在结构中引入3-氟代氮杂环丁烷得到JF6353,λabsem=635 nm/652 nm,εw=1000 M-1CM-1,Φ=0.54),其表现出较低的KL-Z值(<0.0001)和强荧光。作者还用类似方法得到了荧光染料4-7(Figure 1c,Table 1)。接着,作者又以含氧罗丹明为基本骨架得到荧光团JF5529)和JF52610)。除此之外,作者还通过将3,3-二氟氮杂环丁烷取代JF6084,λabsem=608 nm/631 nm,Φ=0.67)中的氮杂环丁烷环,得到具有明亮荧光的化合物JF5855,λabsem=585 nm/609 nm,Φ=0.78)。



(来源:ACS Central Science

 

随后,作者研究了Si-罗丹明 110(8)的各项性质。作者以化合物11与氨基甲酸叔丁酯为原料,利用Pd催化的交叉偶联反应,随后用TFA脱保护得到化合物8(SiR110,λabsem=587 nm/609 nm,Φ=0.53;Figure 2a)。相较于SiR,SiR110蓝移~50 nm,但荧光量子产率增加。作者从6开始合成了SiR110-Halo Tag配体(8HTL,Figure 2b)并测试其光谱性质,发现其与Halo Tag蛋白结合后荧光吸收增加7倍(Figure 2c),并与KL-Z趋势成线性关系(Figure 1e)。该染料可用于标记细胞成像(Figure 2d),且具有更好的光稳定性(Figure 2e)。以上结果进一步证明了低的KL-Z值与罗丹明的强荧光息息相关



(来源:ACS Central Science

 

随后,作者致力于开发合成JF552衍生物的一般策略,希望适用于不同氮杂环丁烷基官能团的取代。作者以3-溴-4-氟苯酚(17)为原料进行一系列缩合、偶联、脱保护反应得到JF552JF552-HaloTag配体9HTL(Scheme 1b)和JF549JF552的甲氧苄啶(TMP)缀合物6TMP9TMP(Scheme 1c)。接着,作者在酵母细胞核中对这些物质的荧光标记效果进行一定的评估。其中,6HTL显示出较差的标记效果(Figure 3a),而9HTL在同样条件下却表现出强荧光信号(Figure 3b)。




(来源:ACS Central Science

 

接着,作者将化合物79的结构修饰方法结合,得到新的荧光团六氟化罗丹明10(Figure 4a)。作者用类似JF552配体的途径合成6-羧基衍生物(Scheme 1b);同样的,作者经过一系列交叉偶联、脱保护反应得到JF526-HaloTag配体(10HTL)和JF526-SNAP-tag配体(10STL,Figure 4b),并在活细胞中与JF525-HaloTag(7HTL)比较成像效果。结果表明,无论是使用HaloTag(Figure 4d,e),还是SNAP-tag配体(Figure 4f,g),JF526均表现出比JF525更高强度的荧光信号。



(来源:ACS Central Science

 

作者进一步合成了多种JF526配体,探究染料在多色显微成像中的应用,其中JF526-Hoechst(10HST)用于DNA的染色,JF526-紫杉醇(10TXL)用于微管的染色以及JF526-胃蛋白酶抑制剂A(10PEP)用于溶酶体的染色(Figure 4b and 5a)。随后作者用这些物质实现了单色、双色和三色免洗成像实验(Figure 5b-d)。同时,作者用10PEPJF646-Hoechst(2HSTFigure 6a)实现了在活细胞中的双色3D-SIM成像;用10TXL实现了微管的多色超分辨STED成像(Figure 6b)。特别的,作者用JF526-Taxol(10TXL,微管),JF646-SNAP-tag配体(2STL,内质网)和JF585-HaloTag配体(5HTL,线粒体)用于活细胞的三色STED成像(Figure 6c)。用10PEP2HST实现了双色格栏光片显微成像(Figure 6d)。




(来源:ACS Central Science

 

最后,作者利用罗丹明染料的内酯-两性离子平衡特性进一步用于单分子定位显微成像(SMLM)。羟甲基-SiR(HM-SiR,32)主要以非荧光的螺环醚形式存在,但在生理pH下条件下,其能质子化产生瞬态荧光(Figure 7a)。为了评估HM-JF526在SMLM实验中的性能,作者使用37标记山羊抗小鼠二抗,然后在固定细胞中免疫染色抗β-微管蛋白一抗。SMLM图像显示出微管的精细结构(Figure 7e)。作者利用抗TOMM20一抗标记线粒体,与衍射限制图像相比,罗丹明染料提供了具有更高分辨率的线粒体SMLM图像(Figure 7f-h)。

 

(来源:ACS Central Science

 

总而言之,作者运用各种修饰方式改变罗丹明的KL-Z值,并证明了KL-Z在合理设计自发闪烁的罗丹明荧光团中的重要性。同时,作者探究了一种普适性方法用于荧光团结构的改造,这有利于设计合成更多小分子用于活细胞和生物体内的功能成像。


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