FC：中国水产科学研究院南海所李来好研究团队通过代谢组学解密中国鱼露的“鲜之密”

 

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编者按：

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题为“Application of UHPLC-Q TOF-MS-based metabolomics in the evaluation of metabolites and taste quality of Chinese fish sauce (Yu-lu) during fermentation（基于UHPLC-Q TOF-MS的代谢组学在中国鱼露发酵过程中代谢产物和滋味品质评价中的应用）”的研究文章，采用UHPLC-Q / TOF-MS的代谢组学方法基于当量化和滋味活性值（TAV）评估中国鱼露的滋味品质和代谢物谱。氨基酸，小肽，有机酸，胺，碳水化合物和核酸在内的46种代谢物确定为鱼露的关键化学成分。该文带我们了解中国鱼露鲜味的秘密，该研究也为其他想用代谢组学研究发酵鱼或肉制品，以及其他食品提供了借鉴意义。

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科学私享

2019.06.09

DOI：10.1016/j.foodchem.2019.05.043

文章概述

自然发酵是加工优质鱼露的关键步骤。在这项研究中，首次采用UHPLC-Q / TOF-MS的代谢组学方法基于当量化和滋味活性值（TAV）评估中国鱼露的滋味品质和代谢物谱。在发酵过程中从鱼露样品中总共提取了22,816个代谢物离子特征。包括氨基酸，小肽，有机酸，胺，碳水化合物和核酸在内的46种代谢物确定为鱼露的关键化学成分。此外，绝对定量和TAV显示天冬氨酸和谷氨酸对鱼露的鲜味有重要影响。特定代谢物主要与氨基酸代谢有关，特别是精氨酸和脯氨酸代谢的改变。该研究鉴定了化学成分，并提供了由发酵引起的鱼露滋味品质的新见解。

1背景介绍

鱼酱，在中国称为鱼露，是亚洲国家的传统调味品，在全世界逐渐普及（Gildberg，Wichaphon，Lertsiri，Assavanig，Sørensen，＆Thongthai，2007; Sasaki，Araki，Michihata，Kozawa， Tokuda，Koyanagi，et al.，2015）。鱼露是一种清澈的棕色液体，通过加入盐（20-30％w / w）后由各种鱼类（如凤尾鱼，沙丁鱼和鲱鱼）自然发酵而产生。在自然发酵的整个过程中涉及多种微生物群落。风味是发酵水产品的重要特征，包括气味和滋味。与鱼露发酵相关的微生物群落为其提供了独特的风味，同时也是酶和必需营养素的来源（Lopetcharat，Choi，Park，＆Daeschel，2001）。水产品中的滋味物质主要包括由三磷酸腺苷（ATP）降解产生的5'-核苷酸和蛋白质水解产生的游离氨基酸（Hwang，Chen，Shiau，＆Jeng，2010）。鲜味不是这些物质的简单积累的结果，而是由于它们之间的协同作用（Manninen，Rotola-Pukkila，Aisala，Hopia，＆Laaksonen，2018）。

由于涉及多种微生物群和潜在的代谢途径，在传统鱼露的发酵过程中产生多种代谢物。发酵鱼露存在的代谢物仅在产品检验阶段是稳定的。尽管许多人研究过发酵过程中鱼露的变化，但总体代谢物谱尚不清楚（Jiang，Zeng，Zhu，＆Zhang，2007; SH Lee，Jung，＆Jeon，2014,2015）。鱼露中的代谢物通过大量代谢途径之间的相互作用形成。由于传统的单组分分析方法如HPLC和GC的局限性，需要代谢组学方法来全面研究发酵过程中鱼露的化学成分。代谢组学是“组学”这一广泛领域的一门新学科，涵盖了基因组学，转录组学和蛋白质组学的主题。代谢组学方法能够同时检测和表征由各种代谢过程形成的低分子量代谢物（Klevorn和Dean，2018; DE Lee，Shin，Lee，Jang，Shin，Moon等，2016; Mozzi，Ortiz，Bleckwedel，Vuyst，＆Pescuma，2013）。与核磁共振技术相比，色谱质谱具有灵敏度高，分辨率高的优点，是发酵食品样品代谢组学研究的重要工具，含有多种小分子代谢物，极大跨度，表现出大浓度动态范围（Singh，Lee，＆Lee，2017）。

阐明生产鱼露的质量和风味决定成分的代谢途径有利于有效监测和有针对性地调节鱼露实际生产中的质量变化。基于代谢组学的方法最近用于研究各种发酵食品，如泡菜（Seo，Park，Kim，Lee，Na，＆Son，2018），绿茶（J. Liu，Zhang，Liu，Ma，Shi， ＆Ruan，2016），蟹酱（Chen，Ye，Chen，＆Yan，2016）。尽管基于代谢组学的策略具有阐明发酵食品的代谢物谱的功效，但据我们所知，这些方法尚未用于表征中国鱼露发酵过程中代谢物的变化。我们推测代谢组学方法可用于表征关键代谢物的动态变化，从而确定发酵过程中鱼露的营养和感官品质，从而为发酵过程中鱼露的口味质量提供新的见解，并为未来的研究提供指导。

2 材料与方法

2.1 鱼露样品的制备

本研究的鱼露样品由中国广东省的一家当地鱼露加工厂提供。先前已经描述了鱼露生产工艺（Y.Wang，Li，Li，Yang，Wu，Zhao，et al.，2018）。用于制备鱼露的凤尾鱼在南海收集，并在-20°C下运到工厂。本研究中使用的原料鱼的体长为20±3.0cm，体重为150±30.0g。解冻后，将整个鱿鱼整齐地放入发酵罐中，然后加入30％的盐并与鱿鱼混合。将发酵罐每天搅拌两次，并在开放环境（25±10℃和60±15％RH）下自然发酵鱼露。因此，在取样过程中必须避免外部细菌的影响。在该研究中使用的发酵液在上表面下方8至12cm处取样。在制备的无菌取样瓶中在发酵开始后1，3，6，9和12个月收集样品，并在24 h内在液氮中运输到实验室。将发酵液混合，然后用1级定性滤纸过滤，将收集的滤液储存在-80℃的冰箱中直至代谢物提取。

2.2 从鱼露样品中提取代谢物

根据先前的方法（Chen，Ye，Chen，＆Yan，2016）进行代谢物的提取，并进行一些修改。通过在湿冰上的10-mL离心管中加入1mL 70％甲醇，在12h内将三份鱼露样品（0.2g）萃取两次。然后将混合物以12,000g在4℃下离心10min。离心后，通过在真空中冷冻干燥处理上清液。将每种鱼露样品提取物在200 μL70％甲醇中重构。

2.3 通过UHPLC-Q-TOF-MS进行代谢组学分析

采用超高压液相色谱（UHPLC）用于色谱评估（Agilent，Palo Alto，CA，USA）。鱼露样品的色谱分离在Zorbax Eclipse Plus C18柱（100×2.1mm，1.8μm，Agilent Technology，Little Falls，DE，USA）上进行。使用二元流动相以0.5mL / min的流速洗脱化合物，其中溶剂A是含有0.1％甲酸（v / v）的水，溶剂B是含有0.1％甲酸（v / v）的乙腈。使用以下线性梯度洗脱程序：0-2 min，2％B; 2-13 min，2-90％B; 13-16 min，99％B; 16-16.1min，99％-2％B; 16.1-20min，2％B。将柱保持在40℃并且保持注射量为0.5μL。为了避免仪器检测信号波动的影响，以随机顺序连续分析样品。将质量控制（QC）样品插入样品队列以监测系统稳定性并确保实验数据的可靠性。Q-TOF质谱（MS）使用Triple TOF 5600+系统（AB / Sciex，Foster City，CA，USA）进行，该系统配备有以正（ESI +）和负（ESI-）离子模式操作的电喷雾电离源（ESI）。ESI源条件如下：离子源气体1，40psi; 离子源Gas2，8 psi; 窗帘气体，30 psi; 源温度，650°C; TOF MS扫描m / z范围：60-1000 Da; 产物离子扫描m / z范围：25-1000 Da; TOF MS扫描累积时间为每个频谱0.20 s; 产品离子扫描累积时间每个光谱0.05 s（J. Liu，Zhang，Liu，Ma，Shi，＆Ruan，2016; H. Wang，Liu，Wang，Cui，Zhang，Liu，et al.，2017）。

2.4 数据分析

使用ProteoWizard将生成的数据转换为mzML格式，并使用XCMS进行峰对齐，保留时间校正和峰面积提取。查询结果并与实验室标准数据库（北京邦飞生物科技有限公司，中国北京）进行比较。排除两组超过50％的缺失值的提取离子特征，并通过Pareto缩放对离子峰数据进行归一化（H.Wang，et al.，2017）。MetaboAnalyst 4.0用于多变量数据分析（Jasmine Chong，Othman Soufan，Carin Li，Iurie Caraus，Shuzhao Li，Guillaume Bourque，et al.，2018），包括主成分分析（PCA）和偏最小二乘判别分析（PLS-DA）。基于变量重要性指标（VIP）和学生t-测试（p值）的统计学明确阈值用于识别发酵时间点之间存在显著差异的代谢物(Luo, Deng,Yuan, Deng, & Jin, 2017).

2.5 鉴定和定量游离氨基酸

如前所述进行游离氨基酸的提取和鉴定（Jiang，Zeng，Zhu，＆Zhang，2007）。检出限（LOD）和定量限（LOQ）分别为0.01μmol/ L和0.02μmol/ L。使用真实的氨基酸标准品（Sigma-Aldrich，St.Louis，United States）鉴定和定量每种氨基酸。

2.6 5'-核苷酸的鉴定和定量

将鱼露样品（5mL）冷冻干燥并溶解在适量的超纯水中。将溶液通过0.45-μm过滤器过滤，使用Agilent 1100 HPLC进行分析。CNW Athena C18-WP柱（250 mm×4.6 mm，5μm）用于5'-核苷酸鉴定。HPLC条件如下：UV检测器，254 nm; 流动相，0.01M KH 2 PO 4 / H 3 PO 4（pH 4.68）; 流速，0.8 mL / min; 注射量10 μL。LOD和LOQ分别为0.001μmol/ L和0.002μmol/ L。每个5'-核苷酸，包括5'-鸟苷单磷酸（5'-GMP），5'-肌苷单磷酸（5'-IMP），5'-腺苷使用真实的核苷酸标准品（Sigma-Aldrich，St.Louis，United States）鉴定和定量5'-腺苷单磷酸（5'-AMP）和次黄嘌呤（Hx）。

2.7 EUC的计算方法

EUC（谷氨酸一钠）可以反映鲜味氨基酸和5'-核苷酸对滋味的协同作用的总体贡献。EUC由相同鲜味所需的谷氨酸钠（MSG）含量表示，计算如下：

EUC =Σaibi+ 1218（Σaibi）（Σajbj）

Ai是鲜味氨基酸（Asp或Glu）的浓度，g / 100g;

Bi是鲜味氨基酸相对于谷氨酸钠（MSG）的相对新鲜系数（其中Asp为0.077，Glu为1）;

Aj是5'-核苷酸（5'-AMP，5'-IMP，5'-GMP）的浓度，g/100g;

Bj是滋味核苷酸相对于IMP的相对新鲜度系数（5'-IMP是1，5'-GMP是2.3，并且5'-AMP是0.18）。

2.8 感官评价分析

通过定量描述分析（QDA）对不同发酵阶段的鱼露样品进行感官评价分析。评估小组由10人组成，其中包括5名男性和5名女性，年龄在20至35岁之间。在感官评价之前对评估员进行培训，使他们能够区分不同发酵阶段的鱼填充样本。在评估每个样品后，评估员用纯水冲洗口腔。评价的风味主要包括苦味，甜味，鲜味，咸味，酸味，含氨味，鱼腥味和焦糖。评估得分使用10分制（Lawless＆Heymann，2010）。

2.9 代谢途径分析

在该研究中，使用Metabo Analyst中的MetPA工具鉴定与受发酵影响的化合物相关的代谢途径。京都基因和基因组百科全书（KEGG）用作后端知识库（Kanehisa＆Goto，2000）; 将鱼露样品中鉴定的化合物定位于KEGG途径。在KEGG途径富集分析中，每个途径中的所有代谢物都认为是背景。Fisher精确检验用于比较代谢物收集中每种KEGG途径的分布和总代谢物组，以评估显著性水平（Jasmine Chong，et al.，2018; Klevorn＆Dean，2018）。

3 结果和讨论

3.1 发酵过程中鱼露的代谢表型分析

在不同发酵阶段研究的所有鱼露样品中提取总共22,816个代谢物离子特征。在Pareto-scaling后，通过PCA分析从所有实验样品和QC样品中提取的峰。如图1A和B所示，ESI +和ESI-模式中的QC样品（黄色）聚集在一起，表明仪器分析系统具有良好的稳定性。因此，代谢特征的差异反映了鱼露样品之间的组成差异。

▲图1 来自正ESI（A）和负（B）模式的所有样品和QC样品的PCA得分图，以及基于UHPLC -QTOF / MS数据的正ESI（C）和负（D）模式中与发酵时间相关的鱼露样品的PCA得分图。

构建无监督的PCA模型以鉴定全局代谢物中发酵阶段之间的离散差异。如从图1C和D中的UHPLC-Q-TOF-MS数据获得的PCA得分图所示，主要成分分别解释了正ESI和负ESI电离模式的总变异的56.4％和54.5％。在这些2D-PCA评分图中，发酵1个月和3个月的鱼露样品没有完全区分; 然而，在发酵的6，9和12个月时观察到显著的分离。

从大量代谢组学数据集中筛选标记代谢物，建立准确的判别模型，对于控制发酵食品质量和鉴定发酵阶段具有重要意义。使用PLS-DA（图2A和B），加载图中改变的代谢物分别解释了ESI +和ESI-电离模式中总变异的55.4％和51.3％。在ESI +模式（R 2 = 0.992，Q 2 = 0.646）和ESI模式（R 2 = 0.989，Q 2 = 0.599）的PLS-DA得分图上观察到类别之间的明显分离。因此，PLS-DA模型具有更好的分类效率，表明该模型具有高可靠性和预测能力。

▲图2 基于UHPLC-Q-TOF / MS的正ESI（C）和负ESI（D）模式中与发酵时间相关的鱼露样品PLS-DA分数图

3.2 在不同发酵阶段的鱼露样品的代谢物谱

确定VIP以鉴定表达模型对每组中代谢物的分类和区分的影响。基于VIP≥1.5且p <0.05，选择46种代谢物作为关键代谢物，表明它们对鱼露样品的发酵具有显著的影响（表S1）。并且从不同鱼露样品的ESI正负模式中的TIC图如图S1所示。进行聚类分析以研究鉴定的代谢物的关系和相对丰度，使用热图可视化（图3）。热图上不同发酵时间点的代谢物明确分为5组，表明鱼露样品中代谢物丰度在发酵时间点之间存在显著差异，丰度变化与发酵时间有关。

▲ 图3 在不同发酵阶段的鱼露样品中差异代谢物的热图可视化

3.2.1 氨基酸

随着发酵的进行，鱼露中的氨基酸表现出不同的变异模式; 然而，大多数积累的时间。在检测到的氨基酸中，14种（精氨酸，苯丙氨酸，亮氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，甘氨酸，丝氨酸，缬氨酸，组氨酸，酪氨酸，脯氨酸，牛磺酸，焦谷氨酸和鸟氨酸）确定为发酵过程中的关键代谢物。鱼露中这些氨基酸的积累可归因于蛋白水解产物。氨基酸直接导致鱼露的独特味道特征。特别地，发酵食品中的谷氨酸提供鲜味，在初始发酵阶段后观察到增加的水平。苯丙氨酸，组氨酸，酪氨酸和缬氨酸是鱼露酸味的主要决定因素; 这些氨基酸在发酵过程中大量减少。这些结果与韩国鱼露的先前发现不一致（SH Lee，Jung，＆Jeon，2014）。结果的这些差异可能是由于两种研究中的原料，原料预处理方法和细菌种类不同。此外，两种非蛋白质氨基酸的水平，即牛磺酸，一种用于人类健康的生物活性物质和谷氨酰胺代谢中间体焦谷氨酸在鱼露发酵过程中逐渐减少。牛磺酸的损失可能对鱼露的质量产生负面影响。观察到牛磺酸的稳定损失可能是由于腌制造成的，因为其他加工海产品的牛磺酸水平也有类似的下降（Chen，Ye，Chen，＆Yan，2016; Dragnes，Larsen，Maehre，＆Elvevoll，2009; Piras） ，Scano，Locci，Sanna，＆Marincola，2014）。

3.2.2小肽

除了氨基酸的产生之外，在发酵过程中观察到小肽的积累。Glu-Tyr，Glu-Phe和Val-Tyr肽在初始发酵阶段（1个月）高的水平在发酵过程中逐渐降低，比在12月初始发酵阶段低2倍。相反，Val-Leu和Gly-Leu的水平最初较低，并且在整个发酵过程中连续产生。虽然这些肽在鱼露中的功能和感官特性尚未在本研究中进行研究，但许多其他发酵食品（包括鱼露）的研究表明，小肽与人类健康有益，并通过抗氧化剂降低疾病风险，抗高血压，免疫调节，和抗癌活动（Gowda，Narayan，＆Gopal，2016）。以前的研究表明，在各种商业鱼露中发现的γ-谷氨酰基- 缬氨酰-甘氨酸（γ-Glu-Val-Gly）赋予了浓厚的风味并改变了咸味和鲜味（Kuroda, Kato, Yamazaki, Kai, Mizukoshi，Miyano et al.,，2012）。因此，小肽的积累改善了鱼露和相关发酵食品的营养价值和感官品质。

3.2.3有机酸

在该研究中观察到八种有机酸（柠檬酸，苹果酸，乳酸，肌酸，氨基己二酸，壬二酸，亚麻酸和烟酸盐）。在整个发酵期间发现柠檬酸和苹果酸水平持续增加。然而，发酵期间乳酸水平降低。这一发现可归因于乳酸菌的抑制和在发酵过程中鱼露中存在的微生物群落中产生柠檬酸和苹果酸的耐盐微生物的丰度的逐渐增加。肌酸，一种为肌肉和神经细胞提供能量的含氮有机酸（Yang，Ye，Wang，Sun，Pan，＆Cao，2017）在发酵过程中逐渐减少。肌酸已被确定为越南鱼露（Park，Watanabe，Endoh，Watanabe，＆Abe，2010）和干鲱鱼（Clupea pallasii）鱼片（Shah，Ogasawara，Egi，Kurihara，＆Takahashi，2010）中的滋味活性化合物。肌酸的流失可能会增加海鲜的甜度（Chen，Ye，Chen，Zhan，＆Lou，2017）。观察到的肌酸减少与先前对韩国发酵凤尾鱼酱的研究结果一致（Jung，Lee，Chun，＆Jeon，2016）。亚麻酸是鱼酱中存在的ω-3必需脂肪酸，与改善的智力，抗血栓作用和肝脏保护相关（Kim，Nam，Kim，Hayes，＆Lee，2014）。由于使用的分析仪器和检测方法，未检测到挥发性有机酸，例如甲酸在这个研究中; 然而，观察到的大多数有机酸是其他鱼酱样品的主要化学成分（Jung，Lee，Chun，＆Jeon，2016; SH Lee，Jung，＆Jeon，2015）。

3.2.4胺，碳水化合物和核酸

在鱼类腌制和发酵过程中，凤尾鱼失去了抵抗微生物腐败的能力（Udomsil，Chen，Rodtong，＆Yongsawatdigul，2016）。在这个阶段，原料中不存在抑制剂，导致大量腐败微生物（Jung，Lee，Chun，＆Jeon，2016）。组织中的蛋白质，氨基酸和其他含氮化合物在腐败微生物的作用下降解成胺。在三甲胺的水平（TMA）持久性增加发生如三甲胺Ñ在整个发酵期间通过去甲基化降低了氧化物（TMAO）。该结果与TMAO的氧化和去甲基化导致TMA产生并导致发酵鱼酱的难闻气味的想法一致（Jung，Lee，Chun，＆Jeon，2016）。生物胺主要来源于氨基酸的微生物脱羧，与鱼酱的品质特征有关。在这项研究中，两种生物胺（腐胺和尸胺）被确定为发酵过程中的关键代谢物。我们以前证明了腐胺的形成与盐厌氧菌属（Halanaerobium）有关，这是发酵鱼酱中的优势属（Y.Wang，et al.，2018）。鱼酱发酵过程中盐的渗透可能会抑制腐败微生物的生长。胺的生产对鱼酱的质量有不利影响; 因此，控制胺的生产是对于抑制腐败微生物的生长很重要（Gowda，Narayan，＆Gopal，2016）。盐在发酵过程中渗入鱼肉需要一定的时间，这直接影响了防腐效果。由于渗透时间取决于盐的渗透速度，鱼的大小和其他因素，生鱼和盐可以充分混合以加速盐的渗透，从而减少鱼酱发酵过程中的胺产生。应尽可能选择细粒盐和老盐; 此外，最好剁碎然后腌制更大的鱼。

核酸在蛋白质的生物合成中起重要作用（Kang，Yang，Kim，Han，Kim，＆Kwon，2011）。在初始发酵阶段（1个月）低的腺嘌呤和尿苷的含量在发酵过程中逐渐增加。在鱼露发酵过程中，两种碳水化合物即葡萄糖和蔗糖被确定关键代谢物。葡萄糖是最常见的发酵底物，主要来源于鱼类中的糖原，并通过糖酵解转化为丙酮酸。然后通过各种代谢途径将丙酮酸转化为其他代谢物（Chen，Ye，Chen，Zhan，＆Lou，2017）。

3.3 代谢物之间的相关性

为了评估各种代谢物的相互依赖性，使用相关矩阵来确定使用Pearson相关性检验确定的代谢物水平之间的相关性。脯氨酸和精氨酸积累与氨基酸丰度呈正相关（鸟氨酸，甘氨酸，亮氨酸，精氨酸，天冬氨酸和谷氨酸），有机酸（磷酸肌酸，壬二酸，苹果酸和柠檬酸），酪胺，腺嘌呤和果糖，与缬氨酸呈负相关（图4）。此外，果糖和蔗糖与鸟氨酸，磷酸肌酸，胍丁胺，亮氨酸，脯氨酸和精氨酸正相关。值得注意的是，TMAO与大多数氨基酸呈负相关，包括鸟氨酸，甘氨酸，亮氨酸，脯氨酸，精氨酸和谷氨酸; 然而，TMA与这些氨基酸呈正相关，与苹果酸和柠檬酸呈正相关（图4）。然而，大多数氨基酸与生物胺（如腐胺，色胺和组胺）的形成无关。Gly-Leu的变化与亮氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，甘氨酸的变化呈正相关，

▲图4 发酵代谢物的相关图。 每个方块表示Pearson的相关系数值（r）。 正（0<r <1）和负（-1="" <r="" <0）相关分别以红色和绿色表示。

3.4 感官活性代谢物的定量分析和TAV值

为了进一步研究有助于鱼露中味道形成的关键滋味化合物，定量测定氨基酸和核苷酸含量（表1）。TAV，即化合物浓度与其味道识别阈值的比率，用于量化有助于鱼露中味道形成的活性化合物的形成。可归因于氨基酸的味道类型可分为三种类型：鲜味，苦味和甜味。在发酵的初始阶段（1个月），鱼酱中鲜味，甜味和苦味氨基酸的含量分别为476.65,550.22和939.85 mg / 100 mL。发酵12个月后，鲜味氨基酸和甜氨基酸水平分别增加至1345.44和899.17 mg / 100 mL，苦味氨基酸水平降至885.32 mg/100 mL。Glu和Asp占发酵结束时总氨基酸含量的约40％; 这些氨基酸的TAV值分别高达6.4和23.52，这与Jiang等人的结果一致（Jiang，Zeng，Zhu，＆Zhang，2007）。代谢组学分析和HPLC内标法均可用于测量游离氨基酸含量，而代谢组学分析仅表明变异趋势而非实现绝对定量。然而，两种方法都表明氨基酸变异的类似趋势，证明了研究中使用的代谢组学方法的有效性。

核苷酸对鱼产品的鲜味有重要影响。研究表明，在核苷酸核糖部分的5'碳上形成磷酸盐赋予核苷酸鲜味; 典型的代表是5'-GMP和5'-IMP（Dong，Qin，Xue，Du，Lin，Xu，et al.，2018; P. Liu，Li，＆Tang，2012）。此外，5'-AMP是食品中有效的增味剂，可抑制水产品中苦味的产生，产生令人愉悦的甜味，而ATP降解的最终产品Hx则产生苦味（Li，Gu，Yang，Zhou） ，刘和张，2014）。鱼露中的5'-AMP含量在发酵早期持续增加，在后期略有下降，TAV在0.51和0.85之间波动。5' -IMP是ATP降解的中间关键产物; 其含量与发酵过程呈负相关，并在发酵后期逐渐消失。鱼露发酵过程中5'-GMP含量波动; 然而，它的TAV保持在1.5以上的高水平，表明该化合物对鱼露的滋味形成有重要影响。在发酵过程中降解产物Hx的含量从发酵的初始阶段的8.83mg / 100mL增加到发酵12个月后为17.71 mg / 100 mL。虽然在鱼露发酵过程中一些苦味氨基酸和Hx的含量增加，但通过感官评价确定的鱼露产品的总体味道主要是鲜味和咸味，基本上没有苦味。这可能是由于苦味，酸味和咸味化合物之间的相互抑制和抵消，以及谷氨酸和5'-核苷酸协同作用来掩盖苦味物质的影响（Mouritsen，Duelund，Calleja，＆Frost，2017） 。

研究表明，鲜味氨基酸和5'-核苷酸的组合对鲜味有协同作用（Li，Gu，Yang，Zhou，Liu，＆Zhang，2014）。等效鲜味浓度（EUC）被广泛用于食物鲜味特征的研究以评估这种协同效应。结果表明，在发酵的初始阶段（1M），鱼酱中的EUC为10.28g MSG /100g。随着发酵的进行，MSG的浓度增加。发酵1年后，MSG当量高达33.28g MSG/100g（图S4）。换句话说，由100g鱼酱中的鲜味氨基酸和味道核苷酸产生的鲜味效果等于由33.28g谷氨酸钠产生的鲜味效果。

传统鱼露的感官评价分析结果如图S5所示。传统的鱼露有浓郁的咸味和鲜味。随着发酵的进行，鲜味显著增加，而涩味逐渐降低。此外，随着蛋白质逐渐分解成氨基酸，鱼露的甜味和焦糖味也得到改善。这与氨基酸定量分析的观察结果一致，即鲜味和甜氨基酸如Glu，Asp和Gly的含量在发酵过程中呈增加趋势。

3.5 KEGG代谢途径分析各种代谢物

KEGG代谢途径分析对于理解基因功能和连接基因组和功能信息非常有用（Kumari＆Parida，2018）。图5显示了具有最高倍数变化值（log2）的途径。使用KEGG数据库，确定了40个相关途径，涵盖23种特定代谢物。由于发酵而改变的许多化合物参与氨基酸代谢途径。对于与精氨酸和脯氨酸代谢相关的特定代谢物，观察到最显著的改变。这一发现得到了精氨酸和脯氨酸衍生物水平改变的支持，包括谷氨酰胺，鸟氨酸，天冬氨酸，精氨酸，谷氨酸，脯氨酸，肌酸，胍丁胺，腐胺和磷酸肌酸。与组氨酸代谢相关的化合物; 苯丙氨酸代谢; 发酵过程也极大地影响了丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢。氨基酸，如谷氨酸酸，引发发酵食品中鲜味的发展。除了涉及氨基酸的代谢途径外，氮代谢以及淀粉和蔗糖代谢的匹配表明这些物质也可能与鱼露的发酵有关。此外，生物合成途径产生的代谢物受发酵过程的影响。发酵引起与苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸生物合成，氨酰基-tRNA生物合成以及缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸生物合成相关的代谢物化合物水平的变化。

▲图 5 途径分析显示受发酵过程影响最大的代谢和生物合成途径。代表性圆的尺寸越大并且红色强度越深，对相应路径的影响越大。

在鱼露发酵过程中，由于鱼类中的蛋白质和脂肪等营养物质的降解，会产生特定的代谢物。这些代谢物的产生不依赖于鱼酱发酵过程中的代谢。此外，微生物利用营养物质通过各种代谢途径获得能量，碳和氮源。由于这些代谢途径之间的相互作用尚未得到具体探索，本研究的一个局限性是无法解释代谢途径与相关微生物之间的详细关系。为了更好地理解微生物代谢影响传统鱼露发酵过程中风味形成的机制，

4 结论

目前基于UHPLC-Q-TOF / MS的鱼露分析提供了新颖的方法深入了解发酵过程中代谢物变化对滋味品质的影响。包括氨基酸，小肽，有机酸，胺，碳水化合物和核酸在内的46种代谢物确定为鱼露的营养和感官品质的主要贡献者。氨基酸显著改变; 这些改变在鱼露发酵过程中赋予了独特的风味。如绝对定量和TAV所示，天冬氨酸和谷氨酸对鱼露的鲜味有重要影响。随着发酵的进行，鱼露中的味精浓度增加，发酵1年后EUC值高达33.28g MSG / 100g。特定代谢物主要与氨基酸代谢（尤其是精氨酸和脯氨酸代谢），氮代谢，蔗糖代谢，酪氨酸和色氨酸生物合成，氨酰基-tRNA生物合成，苯丙氨酸以及缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸生物合成相关。这些结果证明了代谢组学方法在发酵过程中对鱼露化学成分的广泛表征的实用性，提供了对发酵过程中鱼露滋味品质的新见解，并为未来的研究提供了指导。

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本文涉及到发酵、水产品加工、代谢组学、风味等知识。以下帖子可能对您有帮助。其他感兴趣的可以关注汇总贴。

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