重磅成果 |《Nature Biotechnology》发表辉大基因高保真Cas13蛋白变体，加速RNA编辑工具应用
近年来，CRISPR-Cas13系统因高效率、高特异性等优势成为风靡全球的新型基因编辑工具，但其普遍存在旁切活性而导致的脱靶效应也成为科研界关注的热点。辉大（上海）生物科技有限公司（以下简称“辉大基因”）作为中国首个自主研发CRISPR-Cas13基因编辑工具并拥有底层专利的创新型公司，在Cas13X/Y（https://mp.weixin.qq.com/s/kALPfvuRYeS33oqUny7IVA）的基础之上，通过新一代的工具进化系统，与辉大基因首席科学顾问杨辉研究员带领的课题组合作开发出旁切活性显著降低的高保真Cas13蛋白变体，研究成果“High-fidelity Cas13 variants for targeted RNA degradation with minimal collateral effects”于2022年8月11日在国际顶级学术期刊《Nature Biotechnology》（IF: 68.164）上在线发表。
辉大基因系该论文的第一作者单位，公司技术开发部童华威博士为第一作者。此外，肖庆全博士（现已加入公司）为该论文的共同第一作者。辉大基因创新技术研究院（辉二，辉大基因子品牌）负责人周英思博士、张海南博士等对该研究亦有重要贡献。
该研究综合利用蛋白质改造工程、流式细胞术、体外切割实验、全转录组测序、转基因小鼠、在体基因治疗安全性验证等技术手段，对Cas13（包括Cas13d和Cas13X ）进行蛋白工程化改造、筛选及验证，开发出了具有高效编辑活性但极低旁切活性的高保真Cas13蛋白变体，对基于RNA编辑的基础科学研究、基因治疗策略研发以及后续的临床转化具有重要意义。
降低旁切活性为CRISPR-Cas13系统安全应用打开新大门
CRISPR-Cas13是一类由RNA介导的靶向RNA的基因编辑技术。Cas13蛋白属于2类VI型多结构域单一蛋白RNA内切酶，许多体外研究表明Cas13蛋白激活后不仅具有切割靶RNA的功能，还能对其周围的任意RNA（bystander RNA）进行非特异性地切割，其这一特性也被用于开发RNA检测的方法【1】。
自2015年Cas13a(c2c2)被发现以来，国内外科学家团队陆续报道了更多的CRISPR-Cas13系统（包括Cas13b/c/d/X/Y/bt），并证明了这些系统可以在哺乳动物细胞中对靶RNA进行高效且特异性地敲低【2-5】。相比于Cas9介导的DNA编辑技术，基于Cas13的RNA编辑工具靶向动态转录的RNA，不会对基因组造成永久性改变，而且可以通过剂量调整等方式控制RNA编辑效果，使其具有可逆性，相对来说更安全。
然而，越来越多的证据表明Cas13a、Cas13b、Cas13d等在哺乳动物细胞中普遍存在着旁切活性（collateral activity），会造成严重的脱靶效应【6-7】。最新的研究也表明Cas13（特别是Cas13d ）对动物细胞和个体产生都会造成很大的毒副作用【8-9】。所以，Cas13蛋白本身普遍存在的旁切活性已成为其走向临床应用的最大障碍，如何降低或消除Cas13蛋白的旁切活性显得尤为必要，开发更特异的高保真Cas13蛋白对基于RNA编辑的基础科学研究、基因治疗策略研发以及后续的临床转化均具有重要意义。
高保真Cas13蛋白变体特异性安全性更优
在辉大基因与杨辉研究员课题组合作的这项研究中，研究人员开发了基于绿色荧光蛋白（EGFP）和红色荧光蛋白（mCherry）的双荧光报告系统，用于在哺乳动物细胞中检测Cas13蛋白的旁切效应。通过靶向敲低一种荧光蛋白（如mCherry）的mRNA，检测另外一种荧光蛋白（如EGFP）的表达水平，研究人员发现Cas13a与Cas13d蛋白的激活都能诱导出非常显著的旁切效应。
为了降低或消除Cas13d蛋白的旁切活性，研究人员预测并对比分析了Cas13d的蛋白结构。目前已报道的Cas13家族成员均带有2个标志性的HEPN结构域，其上的RxxxxH保守基序是Cas13核酸酶催化活性位点。当Cas13蛋白与gRNA结合其核酸酶活性被激活后，该催化活性位点会暴露在蛋白表面，继而对周围的RNA进行无差别的切割【10】。
▲图1：高保真Cas13蛋白的工程化设计、筛选及脱靶效应验证
研究人员利用蛋白质工程手段对Cas13d蛋白进行一系列的突变改造，以改变Cas13d蛋白与非靶RNA的相互作用，通过筛选获得了一些具有高效编辑活性但旁切活性显著降低的Cas13d蛋白变体，其中Cas13d-N2V8变体综合表现出最好的特异性，具有最高保真性（high-fidelity Cas13d，hfCas13d）。通过对大量内源基因位点进行RNA敲低的实验，hfCas13d表现出与野生型Cas13d同样的高活性。结合体外切割实验、全转录组分析、转基因小鼠、在体靶向RNA敲降等技术对hfCas13d进行了系统性的脱靶效应验证及安全评估。
综合而言，此项工作开发出了具有高效编辑活性但极低旁切活性的高保真Cas13d蛋白变体，这一新工具显示出更高特异性，而且在基因治疗方面具有更好的安全性。
图2：高保真Cas13蛋白在哺乳动物细胞
及个体中有效性及安全性的评估
值得一提的是，凭借着强大的基因编辑工具开发及优化能力，2021年辉大团队及杨辉课题组在《Nature Methods》上报道了目前最小的RNA编辑工具Cas13X系统（仅775个氨基酸）【5】。该项研究在此基础上也开发出了具有高效编辑活性但极低旁切活性的高保真Cas13X蛋白变体（hfCas13X），其将在基于RNA编辑的基因治疗领域显示出巨大的应用价值和发展潜力，为CRISPR-Cas13系统更安全地推向临床应用奠定了技术基础。
论文链接：
https://www.nature.com/articles/s41587-022-01419-7
参考文献：
1.Gootenberg, J.S. et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science 356, 438-442 (2017).
2.Abudayyeh, O.O. et al. RNA targeting with CRISPR-Cas13. Nature 550, 280-284 (2017).
3.Cox, D.B.T. et al. RNA editing with CRISPR-Cas13. Science 358, 1019-1027 (2017).
4.Konermann, S. et al. Transcriptome Engineering with RNA-Targeting Type VI-D CRISPR Effectors. Cell 173, 665-676 e614 (2018).
5.Xu, C. et al. Programmable RNA editing with compact CRISPR-Cas13 systems from uncultivated microbes. Nat Methods 18, 499-506 (2021).
6.Wang, Q. et al. The CRISPR-Cas13a Gene-Editing System Induces Collateral Cleavage of RNA in Glioma Cells. Adv Sci (Weinh) 6, 1901299 (2019).
7.Ai, Y., Liang, D. & Wilusz, J.E. CRISPR/Cas13 effectors have differing extents of off-target effects that limit their utility in eukaryotic cells. Nucleic Acids Res 50, e65 (2022).
8.Shi, P. et al. RNA-guided cell targeting with CRISPR/RfxCas13d collateral activity in human cells.Preprint at bioRxiv https://doi.org/10.1101/2021.11.30.470032 (2021).
9.Li, Y. et al. Collateral cleavage of 28s rRNA by RfxCas13d causes death of mice. Preprint at bioRxiv https://doi.org/10.1101/2022.01.17.476700 (2022).
10.Zhang, C. et al. Structural Basis for the RNA-Guided Ribonuclease Activity of CRISPR-Cas13d. Cell 175, 212-223 e217 (2018).
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关于辉大基因
辉大（上海）生物科技有限公司（下称“辉大基因”）2018年10月成立于中国上海，现拥有研发实验室、药物工艺开发与分析实验室、模型动物试验中心等超万平米场地。旗下员工逾150人，其中研发团队占70%以上。公司自成立以来，现已完成四轮融资，与多家国内顶级科研机构、医院达成深度合作。
辉大基因致力于基因治疗药物的研发，长期目标是利用基因编辑技术治疗遗传病以及威胁人类健康的慢性疾病。研发管线涵盖中枢神经、眼科、肌肉、听力等多个领域，拥有多项全球领先水平的技术平台，涵盖从药物靶点筛选、药物优化、高效动物模型构建，到药效、毒理分析等临床前研发，再到药物工艺开发、生产转化CMC以及药品临床及注册申报的一体化研发能力。
辉大基因坚持以人为本，创新驱动，让基因治疗惠及千百万患者，致力成为全球领先的生物制药公司。
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