科研干货|关于荧光定量PCR的一切

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今日跟大家聊聊——荧光定量PCR

荧光定量PCR

荧光定量PCR（realtimefluorescence quantitative PCR，RT-qPCR） 是1996 年由美国Applied Biosystems 公司推出的一种新定量试验技术，它是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，进而对待测样品模板进行定量分析。

实验原理

将标记有荧光素的探针与模板DNA混合后，完成高温变性、低温复性、适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板DNA互补配对的探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光；随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct值（Cycle threshold，循环阈值，每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数），同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照，即可得出待测标本目的基因的拷贝数。

一般使用的方法是SYBR® Green 染料插入法，SYBR® Green I 染料是一种荧光 DNA 结合染料，可与双链 DNA 的小沟结合。激发与 DNA 结合的 SYBR® Green染料可产生较未结合染料更强的荧光信号。

实验方法

实验步骤

第一部分RNA提取与定量

a.贴壁细胞 RNA 提取流程

1.   使用至少 106 个细胞，吸出培养基，用预冷的 PBS (1–2 mL) 洗涤一次。

2.   吸出 PBS（尽量吸尽），加入 1 mL TRIzol。

3.   轻轻刮擦培养板，然后用移液器移除 TRIzol，将 TRIzol/细胞裂解物转移到 1.5 mLEppendorf 管中。

4.   将样品在室温下放置 5 分钟。

5.   加入 250 μL 氯仿，剧烈振荡样品管约 15 秒。

6.   将样品在室温下放置 5 分钟。

7.    以 10,000 rpm 离心 5 分钟。

8.   此时每个管中分为三层：上层：澄清水相；中层/中间相：白色 DNA 沉淀；底层：粉色有机相。

9.    用移液器小心吸取水相。如果使用较大的枪头，难以控制吸取液体的速度和力度，这会增加吸入部分有机相或 DNA 的可能性。保留一部分水相（DNA 层以上约 1 mm，避免被 DNA 污染）。将吸取的水相置于另一个 1.5 mLEppendorf 管中。

10.   向水相中加入 550 μL 异丙醇，轻轻混合。将样品在室温下放置 5 分钟。

11.   以最大速度 (14,000 rpm) 离心 20 分钟。如果得率较低，离心 30 分钟。

12.   将样品置于冰上。每个管底应隐约可见一些沉淀物。倒掉异丙醇，加入 1 mL 由 DEPC 水配制的 75% 乙醇。轻轻混合。以 9,500 rpm 离心 5 分钟。

13.   倒掉乙醇，晾干沉淀物。此步骤非常关键：沉淀物过于干燥会导致 RNA 结晶且难以重新溶解；乙醇蒸发不充分也会阻碍 RNA 溶解。倒掉大部分乙醇洗涤液之后，Eppendorf 管底将剩下约 30–40 μL 乙醇。为了加速蒸发，可将管瞬时离心，迫使管壁上的残余液体转移到管底，然后尽量吸除乙醇。当沉淀周围只剩一小块半月形的溶液时，是向 RNA 沉淀中加入 DEPC 水的最佳时机。

14.   向 RNA 沉淀中加入约 15–25 µL（具体取决于得率）DEPC 水。

b.组织 RNA 提取流程

此流程与细胞 RNA 提取流程的唯一不同之处在第一步。向无菌培养管（优选 12 × 75 mm）中加入 1 mL TRIzol。向该管中加入冷冻组织（尽量将加入量控制在约 20 mg 以下）。在冰上用匀浆器研磨组织，匀浆器设置为 25/30，总共研磨2 次，每次 10 秒。然后将 TRIzol 溶液倒入 1.5 mL Eppendorf 管，按照上述步骤处理（从第 4 步开始）。

在进行第二部逆转录之前，我们需要对RNA质量进行检测（使用仪器为Narodrop 2000）

RNA纯度说明：

一般来说OD260代表核酸的吸光度，OD280代表蛋白质的吸光度。OD230代表其他杂质（多糖等）的吸光度。一般认为，OD260/OD280的比值在1.8至2.0之间可以进入下面逆转录实验。当比值低于1.8时，考虑有蛋白质或酚污染；当比值高于2.0时，表明可能有异硫氰酸残存。 RNA 浓度即为 260 nm 处 OD 值所对应的浓度（单位为 µg/µl）。

第二部分逆转录实验

（该步骤一般使用试剂盒进行）

试剂盒中经常使用的逆转录酶是M-MLV逆转录酶，它是由一个71 kD的单亚基组成的重组型DNA逆转录聚合酶。可以催化以RNA或DNA：RNA杂交链为模板的互补DNA 的聚合反应。本酶经修饰RNase H活性比普通的逆转录酶要弱很多，因此在合成第一链cDNA的过程中，可保证RNA的降解程度较低，从而使得率提高。

RT-PCR Kit(逆转录试剂盒）是专为两步法RT-PCR第一步实验配制的、具有高灵敏度的RT-PCR反应系统。该系统合理配备了与cDNA第一链合成反应相关的各种组分，优化的体系保证了M-MLV具有高效的逆转录酶活性，所得cDNA对后续的PCR或定量PCR实验兼容性好，可用于检测稀有基因的表达、从极少数细胞中定量检测特定mRNA的表达水平、克隆特定基因的cDNA片段等。

第三部分荧光定量PCR实验

（SYBR GREEN 1 插入法）

所用仪器如下（BIO-RAD cfx96）

反应体系如下：

荧光定量PCR实验引物设计原则：

荧光定量PCR实验常用的内参选择:

GAPDH 和β-actin是两种常用的内参基因，是常见的持家基因（管家基因），在多数情况下稳定表达。

第四部分数据分析

Ct值最大的意义就是用来计算目的基因的表达量，此时就有两个概念容易被提及，那就是绝对定量和相对定量，绝对定量的目的是测定目的基因在样本中的分子数目，即通常所说的拷贝数。相对定量的目的是测定目的基因在两个或多个样本中的含量的相对比例，而不需要知道它们在每个样本中的拷贝数。

Ct值诚然可以被利用来计算这两种定量结果，但是绝对定量实验必须使用已知拷贝数的绝对标准品，必须做标准曲线。相对定量可以做标准曲线，也可以不做标准曲线。绝对标准品制作困难难以获取，实验室基本都是选择相对定量的方法来计算相对基因表达量。

以研究基因的表达差异的相对定量为列，目前常用的方法是KJ Livak(Applied Biosystems)等人在2001年提出的“比较Ct法相对定量 ”。

ΔΔCt

相对定量=2-ΔΔCt

ΔΔCt=实验组ΔCt（目的基因Ct值-内参基因Ct值）-对照组ΔCt（目的基因Ct值-内参基因Ct值）

外包检测

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送样注意事项

1.实验材料的选择：血液样本—选择新鲜血液，不得超过4小时；细胞样本—选择处于生长旺盛的时期收集新鲜的细胞；动物组织—选择新鲜、生长旺盛的组织；植物组织—选择新鲜的幼嫩组织。

2.实验材料的保存： 一般来说，我们不建议对样本进行保存，如果条件允许的话。但是不乏有很多朋友无法在采样后立刻进行实验，有的甚至需要背着液氮罐到野外采样，常规的保存方法就是液氮保存，把样本带回实验室以后，保存在-80℃冰箱即可。

3.实验材料的邮寄：样本建议干冰运输，对于细胞类样本，搜集至少绿豆大小，PBS洗两次，最后倒掉全部的液体干冰运输，对于已提取好的RNA样本，建议逆转录为cDNA后邮寄，其他有关样本准备或者邮寄问题，请咨询科学指南针工作人员。

参考资料：

[1] Gaedigk A, FreN, Hartshorne T, et al. SNP genotyping using TaqMan® technology: the CYP2D6*17 assayconundrum[J]. Scientific Reports, 2015: 9257-9257.

[2] DidelotA, Corre D L, Luscan A, et al.Competitive allele specific TaqMan PCR for KRAS,BRAF and EGFR mutationdetection in clinical formalin fixed paraffin embeddedsamples[J]. Experimentaland Molecular Pathology, 2012, 92(3): 275-280.

[3] Analyzing real-time PCR data by thecomparative Ct method. TD Schmittgen, KJ Livak -Natureprotocols, 2008

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