为什么胚胎在—196℃条件下保存不会死亡？

1 问题提出

人教版 《现代生物科技专题 》模块专题 “胚胎工程 ” P.77在描述胚胎移植的基本程序时提到，可以将胚胎 “放入-196 ℃的液氮中保存”。学生和教师常常对此产生疑问：在-196 ℃的超低温条件下，胚胎细胞不会死亡吗？细胞内水分不会结冰吗？细胞内水分结冰后还能进行正常的新陈代谢吗？结冰发生反膨胀不会对细胞的结构造成损伤和破坏吗？要弄清以上问题，我们必须深入了解胚胎冷冻保存的原理和处理方法。下面就这些问题作简要分析。

课本P.77图↑

2 分析

胚胎冷冻保存就是利用一定的冷冻技术将胚胎保存于-196 ℃的液氮中，使细胞的新陈代谢和分裂暂时停止，处于休眠状态，从而达到长期保存的目的。通过冷冻可以保存胚胎，但也不可避免地会对其造成损伤。

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视频：液氮速冻鱼复活实验↑

2.1 胚胎冷冻造成的细胞损伤机制

2.1.1物理损伤。在胚胎冷冻过程中，如果降温速度过快，当温度下降至某一临界点，细胞内水分来不及渗透到外部时，胞内就会形成冰晶，胞内冰晶过大会破坏细胞器，刺穿细胞膜，从而对胚胎细胞造成致命的机械损伤。同时，在-15 ℃~-50℃的温度条件下，细胞内液处于超冷状态时，如细胞尚未充分脱水，一旦结冰，冰晶将会迅速集聚，引起温度瞬间剧增，也会对细胞产生相当大的损伤。

2.1.2 溶液效应。如果降温速度过慢，细胞就有充分的时间向细胞外渗透水分，使细胞内部溶质浓度增大 ，导致细胞过度脱水，细胞强烈收缩。由于细胞内部长时间处于高浓度溶液状态下，这种高浓度的电解质可使蛋白质变性，同时破坏细胞膜，引起细胞膜上脂蛋白复合物的变性和部分脂类物质的丢失，增加了细胞膜对阳离子的通透性，在细胞膜上形成一些小孔，造成对胚胎的不可逆损害。

2.2 冷冻保护剂的种类及作用机制

利用冷冻保护剂减少胚胎在低 温状态下受到伤害的方法来自于自然的启示。科学家研究发现，多数耐冻动物能在冷冻中存活的关键原因是它们在低温下体内能产生大量的低分子防冻剂，如葡萄糖、甘油以及许多其他醇类和糖类，这些化合物通过在冷冻和解冻过程中减少渗透性损伤和阻止冰晶的形成来保护细胞结构 。

2.2.1 渗透性冷冻保护剂。渗透性冷冻保护剂多是一些小分子物质,在温度为0 ℃以上时，很容易通过细胞膜进入细胞质，也称之为细胞内冷冻保护剂。此类冷冻保护剂在溶液中易与水分子结合形成氢键，使溶液的猫性增大，从而弱化了水的结晶过程，细胞内冰晶形成的温度显著降低，这样使胚胎有更多的时间把细胞内的水分脱出，避免细胞内形成大量冰晶。冷冻保护剂进人细胞，替换出细胞内的部分水分，进一步减小细胞内形成冰晶的可能性，同时改变了细胞内的过冷状态，使细胞内压接近外压，降低了细胞脱水的速度和由于脱水引起的皱缩程度。常见的渗透性冷冻保护剂有甘油、二甲基亚砜、丙二醇和乙二醇等 。

2.2.2 非渗透性冷冻保护剂。非渗透性冷冻保护剂一般是一些分子量相对较大的物质，能溶解于水，但不能进人细胞，也称之为细胞外冷冻保护剂。其保护机制主要是在胚胎冷冻过程中通过提高细胞外液的浓度而产生跨膜的渗透压梯度，将水分从细胞内吸出使细胞脱水，发挥非特异性保护作用 解冻时，解冻液中含有该类保护剂，为细胞提供一个高渗环境，防止水分进人细胞太快而引起细胞膨胀破坏。常用的非渗透性保护剂有蔗糖、聚蔗糖、海藻糖、聚乙烯毗咯烷酮。

2.3 常用的胚胎冷冻方法

目前用于胚胎冷冻保存的方式有慢速冷冻 、快速冷冻、玻璃化冷冻 。慢速冷冻和快速冷冻由于胚胎冷冻效果较差、操作相对复杂而逐渐被淘汰。玻璃化冷冻技术由于耗时短、操作方便，越来越受到研究者的重视。下面就玻璃化冷冻法作简要介绍。

含有高浓度冷冻保护剂的溶液快速降温达到或低于-100 ℃~-110 ℃的温度范围时，会形成一种高勃度的介于液态和固态之间、非晶体的玻璃态。玻璃化冷冻技术的基本原理就是用高浓度的冷冻保护剂溶液将细胞内的水分置换出来，经急速降温，细胞内外溶液由液态转化为玻璃状半固体，同时保留细胞内外液体正常的分子和离子分布，但无冰晶形成，避免了冰晶形成对细胞膜及细胞骨架结构的损伤。玻璃化冷冻主要操作步骤简单，包括选用两种或两种以上渗透性不同的保护剂配成高浓度的混合液— 玻璃化液，室温下将胚胎直接装人含有玻璃化液的塑料细管中如图，经平衡处理后投人液氮保存。

这种方法冷冻 ,无需冻前分步添加抗冻剂的繁琐步骤，简化了冷冻过程，不需要昂贵的程控冷冻仪器，是一种简便、快速、有效的冷冻方法。近些年来，该方法在胚胎冷冻保存中取得了较好的效果，受到越来越多研究者的重视，是促进胚胎移植产业化的关键技术之一。

3 小结

在胚胎冷冻过程中，不论是使用渗透性还是非渗透性保护剂，主要目的都是为了给细胞造成脱水状态，但脱水的同时不能影响细胞的生存。理想的冷冻方案是找到细胞含水过多和脱水过度之间的平衡点合适剂量的冷冻保护剂，既可以取代细胞质膜周围的水分子，又避免“溶液效应” 合适的冷冻速率。

综上所述，我们可以知道胚胎冷冻保存实质上是一个脱水过程，在胚胎冷冻前，要尽量减少胚胎细胞内的水分，设法减少细胞内冰晶形成所致的损伤，同时又要维持一定的渗透压，使其造成的损伤减到最小。

动物胚胎冷冻技术在多种实验动物和多数家畜胚胎上的实验均已获得成功，并应用于畜牧业生产。但仍然存在诸多问题，如目前使用的保护剂对胚胎均有一定的毒性，胚胎冷冻解冻后体外培养和移植后的结果还不十分稳定，操作程序仍较复杂等。可喜的是当前这些方面的研究己开始起步，可以预测，在不久的将来，胚胎冷冻技术将会进一步完善和规范化，将与其他胚胎工程技术相结合在畜牧业生产和生物技术领域取得新的突破。

文献来源：胡文斌：为什么胚胎在-196 ℃条件下保存不会死亡？—— 浅析胚胎冷冻保存技术的原理和方法。中学生物教学2013（5）