基因定位(gene mapping )是指利用一定的方法将一个基因确定到染色体上的实际位置。基因定位同基因组作图和基因克隆的关系十分密切。将基因定位在染色体的某一位置上之后，其本身就可作为基因组作图时的一个界标。同时，当在基因组图谱上确定某一基因所在的位置后，就可以按图来分离克隆基因。因此，基因定位是基因组研究的一个重要组成部分。不同生物的基因定位方法不完全相同。
离体培养的亲缘关系较远的动物体细胞相互融合后，杂种细胞往往会排除一种亲本细胞的染色体。例如，人和小鼠的体细胞在细胞质和细胞核均合二为一后，这种杂种细胞每分裂一次，就排除人的一些染色体。经过若干次分裂后，杂种细胞在丢失了人的一部分染色体后达到相对稳定的状态。这时杂种细胞包含了小鼠的全套染色体和人的一条或几条染色体。当一些杂种细胞所含的人的染色体，加在一起涵盖了人的全部染色体，即22条常染色体，X和Y染色体时，这些杂种细胞就构成了整套杂种细胞系，可用于人的基因定位。常用的有克隆分布板法和利用染色体异 常将基因定位在染色体上具体位置的方法。例如，利用染色体缺失进行定位。此法无须从病人体内获得有关染色体异常的细胞，而是用人工方法在体外造成杂种细胞内特定染色体的不同位置发生断裂，形成各种类型的末端缺失，获得一套特定染色体的缺失杂种细胞，然后通过检测缺失杂种细胞内基因产物存在与否对许多基因进行区域定位。1986年复旦大学遗传研究所利用此法, 将编码乙醇脱氢酶基因首先定位在染色体的相应位置上。这是分子水平和染色体水平相结合的基因定位方法。将待定位基因的特定DNA序列、该基因转录产生的RNA分子或RNA分子经反转录产生的cDNA作为探针，在标记了放射性同位素或非放射性化学物质后，与变性后的染色体DNA杂交，该探针就会同染色体DNA中与其互补的序列结合成为双链，通过放射自显影或显色技术，就可显示标记了放射性同位素或非放射性化学物质的探针在染色体上的位置，达到基因定位的目的。这是杂种细胞基因定位法的发展。基本原理是人-鼠杂种细胞中的人染色体是经射线处理后残留下来的带有着丝粒的染色体片段，不同的杂种细胞带有人的不同染色体的不同长度的片段。在基因定位时，如待测基因出现在残留的一个长片段上，而在比该长片段更短一些的片段上消失不见，就可把该基因定位在长片段变成短片段时所丢失的那个区域内,这样的基因定位就更为精细。为此，需要建立一系列含有不同长度的人的各条染色体的杂种细胞。目前常用的方法是用PCR技术来确定哪条染色体或哪条染色体片段的DNA中，含有待定位的基因，然后用电脑软件 分析数据，将待测基因定位在染色体的某一位置上。采用已克隆基因的cDNA探针与保留在杂种细胞内的人染色体DNA进行分子杂交，来确定克隆基因所在的染色体。例如，要定位人体白蛋白基因，需要应用人白蛋白基因cDNA作为探针，分别与经过Hind III酶切后的人体细胞和中国仓鼠卵巢细胞（CHO）杂交。杂交后的人体细胞DNA显示6.8 kb带型，CHO细胞的DNA显示3.5kb带型。接下来，将含有人染色体的人-CHO杂种细胞的DNA用Hind III酶切后，再与白蛋白基因的cDNA探针杂交。结果显示，含有人4号染色体的杂种细胞的实验组岀现6.8 kb和3.5 kb带型者，称为阳性杂种细胞；而不含有人4号染色体的杂种细胞中只显示3.5 kb带型，为阴性细胞。由于人体白蛋白基因的cDNA探针的特异性，Hind III杂交带只出现在含有人4号染色体的杂种细胞中，所以将此基因定位在4号染色体上。完成基因组测序后，可以在解读整个基因组的基础上，寻找和定位基因。常用的方法有两种。其一，根据已知的序列人工判读或计算机分析寻找与特定基因有关的序列；其二，实验研究，看其能否表达基因产物及其对表型的影响。