《Cell》重磅：北京大学张泽民课题组与勃林格殷格翰联合发表关于单细胞测序刻画肝癌免疫微环境动态特征的研究

北京大学生命科学学院、北京未来基因诊断高精尖创新中心（ICG）、生物医学前沿创新中心（BIOPIC）张泽民课题组、首都医科大学附属北京世纪坛医院彭吉润课题组以及德国药企勃林格殷格翰（Boehringer Ingelheim）公司肿瘤免疫与免疫调节部门多位科学家，在国际期刊Cell上发表了题为Landscape and Dynamics of Single Immune Cells in Hepatocellular Carcinoma（单细胞测序刻画肝癌免疫图谱与动态变化的研究）的研究论文，结合10x Genomics和SMART-seq2单细胞RNA测序技术，对肝癌患者多个组织的免疫细胞做出了系统性的刻画，分析了免疫细胞动态迁移和状态转化的特征，描绘了肿瘤浸润免疫细胞跨组织的动态过程，探索了它们在肝癌治疗上的潜在价值。

肝细胞癌是世界范围内死亡率排名第三的癌症，其中中国的肝癌发病率居世界之首[1]。免疫逃逸被认为是癌症发展的标志之一，目前研究表明，肿瘤存在多种免疫逃逸机制，提出了研究肿瘤微环境中不同免疫细胞状态的重要性[2]。而不同类型的单细胞测序技术则是研究不同类型免疫细胞的状态和动态的有力手段。

该研究课题组组长北京大学BIPOIC张泽民教授表示：“癌症免疫疗法是近年新兴的治疗方法，逐渐成为癌症治疗领域的新趋势，被认为是能够彻底治愈恶性肿瘤的希望所在。北京大学很高兴能与北京世纪坛医院和勃林格殷格翰三方一起合作，共同研究肝癌微环境中不同免疫细胞的状态，在单细胞水平上描绘肝癌免疫微环境的动态特征，为更多的肝癌患者带来希望。”

勃林格殷格翰肿瘤免疫与免疫调节部门执行总监Emily Corse博士和资深主任科学家刘康博士表示：“这份令人兴奋的工作成果得益于三方的深入、高效、愉快的合作模式。这次全球合作迸发出对肝癌的免疫微环境的重要新洞见，揭示了免疫细胞在肿瘤微环境和其他免疫组织之间的动态迁移变化。这份结合前沿的生信分析技术和生物学验证手段的工作还暗示了免疫细胞迁移理念也适用于其他肿瘤类型的可能性。”

关于单细胞测序刻画肝癌免疫图谱的研究

研究思路

目前单细胞测序技术已经成为探究细胞类群多样性的常用技术手段，而不同的测序技术在细胞捕获和基因捕获效率上具有各自不同的优势[3]。本研究结合了SMART-seq2和10x Genomics Chromium 3’两种单细胞测序技术，并整合这两种平台的数据进行生物信息学分析，充分发挥不同数据类型的优势，获得高分辨率的肝癌免疫图谱。癌旁组织和外周血是肿瘤相关研究中常用的对照组织，而其他相关的免疫器官或病理组织则较少受到关注。例如，腹水是肝癌患者常见的病理现象，其产生与肝癌预后不良有关，然而腹水中的免疫细胞组成及其与肝癌的联系尚不清楚。因此，本研究收集肝癌病人的癌组织、癌旁组织、淋巴结、外周血和腹水五种组织的CD45+免疫细胞进行实验，并分析肝癌免疫微环境中的细胞类型、表达特征，以及不同组织之间细胞的动态变化与联系。

图1 课题总体设计

主要发现

1. 不同组织的免疫组成有较大差异，肿瘤中的巨噬细胞构成腹水中髓系细胞的主要来源

整合两种单细胞测序数据，研究人员刻画了高分辨率的肝癌免疫图谱，包括T细胞、B细胞、NK细胞和髓系细胞等主要细胞类群以及主要类群下属的40类细胞亚群。这些细胞亚群在不同组织中呈现出不同的细胞类型富集特征，其中腹水中的细胞类型呈现明显的特异性。

为探究腹水中细胞的潜在起源，研究者将腹水中的免疫细胞与其他组织中的细胞进行基因表达比对，发现腹水中的淋巴细胞和髓系细胞来源明显不同，淋巴细胞与外周血来源的细胞有明显的相似性，而髓系细胞主要和肿瘤组织来源的细胞类似。随后，通过前沿的生物信息学分析方法RNA velocity[4]和基于线粒体突变的进化树构建[5]，研究者对巨噬细胞从肿瘤到腹水的迁移过程进行了确认。

2. 肿瘤中的巨噬细胞两种不同的状态(TAM-like和MDSC-like)

通过与其他数据中的巨噬细胞进行转录组比对，研究者发现肝癌肿瘤中的巨噬细胞呈现两种不同的状态：TAM-like和MDSC-like状态。生存分析表明，前者的特征基因，特别是SLC40A1和GPNMB与不良预后有关。通过CRISPR技术在THP-1诱导的巨噬细胞系中进行基因敲除和功能验证实验，研究者发现这两个基因在细胞炎症反应中起重要作用。

3. 肿瘤中的LAMP3+ DC是成熟态的DC，具有向肝淋巴结迁移以及与多种淋巴细胞相互作用的潜在能力

肿瘤微环境中的树突状细胞，传统上分为cDC1和cDC2，在本研究中鉴定出一群新的DC，即LAMP3+ DC。通过体外实验和生物信息学分析，研究者发现其可能同时起源于cDC1和cDC2。而且这一类树突状细胞不仅存在于肝癌中，也存在于乳腺癌[6]和肺癌[7]中。

图2 上图：将肝癌组织中树突状细胞的RNA velocity的计算结果投射到在Diffusion Map坐标上，颜色代表不同的细胞群。下图：基于线粒体基因突变构建的LAMP3+ DC进化树

肿瘤浸润性的LAMP3+ DC发挥了广泛调节淋巴细胞的作用，它们与T细胞和NK细胞上表达的配体-受体相互作用数量最多。LAMP3+ DC通过CCL19-CCR7和CCL22-CCR4吸引T细胞，并通过CD86-CD28作用于调节T细胞亚群，通过CD86-CTLA4作用于耗竭性T细胞亚群。研究者通过多色免疫组化对表达PD-1点T细胞与表达PD-L1的LAMP3+ DC进行了空间位置的判断，发现其出现出相邻的位置，为其相互作用提供了另一角度的证据。

讨论

文章的共同通讯作者任仙文副研究员特别指出，本项研究首次对肝癌临床样本进行包括病理组织在内的多组织位点的收集，并利用前沿的生物信息学分析方法，通过自体对照，不仅描述了肝癌微环境的免疫组分和状态，而且描绘了肿瘤浸润免疫细胞跨组织的动态过程。此项国际领先的开创性工作，可为人们研究肝癌和其他疾病中的免疫细胞，以及开发新的临床检测与治疗方案提供新的思路。

北京大学生命科学学院博士生张启明、北京大学前沿交叉学院博士生何尧和北京大学第九临床医学院（北京世纪坛医院）博士生罗楠为该论文的并列第一作者，北京大学BIOPIC和生命科学学院任仙文副研究员、张泽民教授、首都医科大学附属北京世纪坛医院彭吉润教授以及勃林格殷格翰公司资深主任科学家刘康博士为该论文的共同通讯作者。该课题得到了自然科学基金和北京未来基因诊断高精尖创新中心的资助，以及北大高通量测序平台的协助与支持。

关于勃林格殷格翰与北京大学战略合作

2017年5月，北京大学和勃林格殷格翰公司签署协议，建立战略伙伴关系合作，旨在共同推动早期科学创新，以填补肿瘤、肿瘤免疫与免疫调节、呼吸系统、心血管和代谢系统、中枢神经系统疾病以及新兴领域的医疗需求。该战略伙伴合作关系包含多种合作形式，包括以具体科研项目为基础的共同研究、博士后奖学金及研究员奖、系列药物研发讲座等。

北京大学和勃林格殷格翰希望通过战略合作，充分利用高校和企业资源，进行有针对性的创新，带来更多具有突破性潜力的、同类第一（first-in-class）的新药，提高双方的核心竞争力，促进人类健康，实现共赢。

参考文献

1. Forner A., Reig M. and Bruix J., Hepatocellular carcinoma, Lancet 391, 2018, 1301–1314.

2. Gnjatic S., Bronte V., Brunet L.R., Butler M.O., Disis M.L., Galon J., Hakansson L.G., Hanks B.A., Karanikas V., Khleif S.N., et al., Identifying baseline immune-related biomarkers to predict clinical outcome of immunotherapy, J. Immunother. Cancer 5, 2017, 44.

3. Ziegenhain C., Vieth B., Parekh S., Reinius B., Guillaumet-Adkins A., Smets M., Leonhardt H., Heyn H., Hellmann I. and Enard W., Comparative Analysis of Single-Cell RNA Sequencing Methods, Mol. Cell 65, 2017, 631–643.e4.

4. La Manno G., Soldatov R., Zeisel A., Braun E., Hochgerner H., Petukhov V., Lidschreiber K., Kastriti M.E., Lönnerberg P., Furlan A., et al., RNA velocity of single cells, Nature 560, 2018, 494–498.

5. Ludwig L.S., Lareau C.A., Ulirsch J.C., Christian E., Muus C., Li L.H., Pelka K., Ge W., Oren Y., Brack A., et al., Lineage Tracing in Humans Enabled by Mitochondrial Mutations and Single-Cell Genomics, Cell 176, 2019, 1325–1339.e22.

6. Michea P., Noël F., Zakine E., Czerwinska U., Sirven P., Abouzid O., Goudot C., Scholer-Dahirel A., Vincent-Salomon A., Reyal F., et al., Adjustment of dendritic cells to the breast-cancer microenvironment is subset specific, Nat. Immunol. 19, 2018, 885–897.

7. Zilionis R., Engblom C., Pfirschke C., Savova V., Zemmour D., Saatcioglu H.D., Krishnan I., Maroni G., Meyerovitz C.V., Kerwin C.M., et al., Single-Cell Transcriptomics of Human and Mouse Lung Cancers Reveals Conserved Myeloid Populations across Individuals and Species, Immunity 50, 2019, 1317–1334.e10.

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